Fluorescens levetid bildebehandlingsskjermer, kvantifiserer og skiller aggregering tendenser av proteiner i levende, aldring, og stresset C. elegans sykdom modeller.
Amyloid fibriller er forbundet med en rekke nevrodegenerative sykdommer som Huntingtons, Parkinsons eller Alzheimers sykdom. Disse amyloid fibriller kan sequester endogene metastabile proteiner samt komponenter i proteostase nettverk (PN) og dermed forverre protein misfolding i cellen. Det finnes et begrenset antall verktøy tilgjengelig for å vurdere aggregeringsprosessen av amyloid proteiner i et dyr. Vi presenterer en protokoll for fluorescens livstidsmikroskopi (FLIM) som gjør det mulig å overvåke samt kvantifisering av amyloid fibrilization i bestemte celler, for eksempel nevroner, på en ikke-invasiv måte og med progresjon av aldring og ved perturbasjon av pn. FLIM er uavhengig av uttrykksnivåene til fluoroforen og muliggjør en analyse av aggregeringsprosessen uten ytterligere flekker eller bleking. Fluoroforer slukkes når de er i nærheten av amyloid strukturer, noe som resulterer i en reduksjon av fluorescens levetid. Slukkingen korrelerer direkte med aggregeringen av amyloidproteinet. FLIM er en allsidig teknikk som kan brukes til å sammenligne fibrilization prosessen med forskjellige amyloid proteiner, miljømessige stimuli, eller genetisk bakgrunn in vivo på en ikke-invasiv måte.
Proteinaggregering forekommer både ved aldring og sykdom. Banene som fører til dannelse og avsetning av store amyloider eller amorfe inneslutninger er vanskelige å følge, og deres kinetikk er tilsvarende utfordrende å rakne. Proteiner kan misfold på grunn av iboende mutasjoner i deres koding sekvenser, som i tilfelle av genetiske sykdommer. Proteiner også misfold fordi proteostase nettverk (PN) som holder dem løselig og riktig foldet er svekket, som skjer under aldring. PN inkluderer molekylære chaperones og nedbrytning maskiner og er ansvarlig for biogenesis, folding, menneskehandel, og nedbrytning av proteiner1.
C. elegans har dukket opp som en modell for å studere aldring og sykdom på grunn av sin korte levetid, isogene natur, og enkel genetisk manipulasjon. Flere C. elegans transgene stammer som uttrykker menneskelig sykdomsfremkallende proteiner i sårbare vev har blitt opprettet. Viktigere, mange av stammene som inneholder aggregeringsutsatte proteiner rekapitulerer kjennetegnet på amyloid lidelser, dannelsen av store inneslutninger. Takket være C. elegans gjennomsiktige kropp, kan disse aggregatene visualiseres in vivo, ikke-invasivt og ikke-destruktivt2. Generering av ethvert protein av interesse (POI) i fusjon med en fluorophore gjør det mulig å undersøke sine steder, menneskehandel, interaksjonsnettverk og generell skjebne.
Vi presenterer en protokoll for å overvåke aggregering av sykdomsfremkallende proteiner i levende og aldrende C. elegans via fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM). FLIM er en kraftig teknikk basert på levetiden til en fluorophore, snarere enn utslippsspektra. Levetiden (tau, τ) er definert som den gjennomsnittlige tiden som kreves av et foton for å forfalle fra sin spente tilstand tilbake til sin bakketilstand. Levetiden til et gitt molekyl beregnes med tidsdomeneteknikken for tidskorrelert enkeltfotontelling (TCSPC). I TCSPC-FLIM oppnås fluorescerende forfallsfunksjon ved å spennende fluoroforforen med korte, høyfrekvente laserpulser og måle de emitterte fotonens ankomsttider til en detektor i forhold til pulsene. Når du skanner en prøve, opprettes en tredimensjonal datamatrise for hver piksel: matrisen inneholder informasjon om fordelingen av fotonene i x,y romlige koordinater og deres temporale forfallskurve. En gitt prøve blir derfor et kart over levetidsomhet som avslører informasjon om proteinets struktur, binding og miljø3,4. Hvert fluorescerende protein har en iboende og nøyaktig definert levetid, vanligvis av noen få nanosekunder (ns), avhengig av sine fysiokjemiske egenskaper. Viktigere, levetiden til en fluorophore er uavhengig av konsentrasjon, fluorescerende intensitet, og av bildemetoden. Men innenfor et biologisk system kan det påvirkes av miljøfaktorer som pH, temperatur, ionkonsentrasjoner, oksygenmetning og interaksjonspartnere. Levetider er også følsomme for interne strukturelle endringer og orientering. Å koble en fluorofor til et POI resulterer i en endring i levetiden og dermed informasjon om oppførselen til det smeltede proteinet. Når en fluoroforer er omgitt eller innkapslet i et tett bundet miljø, for eksempel de antiparallelle betaarkene i en amyloid struktur, mister den energi ikke-radiativt, en prosess kjent somslukkende 5. Slukking av fluoroforen resulterer i en forkortelse av sin tilsynelatende levetid. Når løselig, et protein levetid vil holde seg nærmere sin opprinnelige, høyere verdi. I motsetning, når et protein begynner å aggregere, vil levetiden uunngåelig skifte til en lavere verdi6,7. Derfor blir det mulig å overvåke aggregeringstilbøyeligheten til ethvert amyloiddannende protein i ulike aldre i levende C. elegans.
Her beskriver vi en protokoll for å analysere aggregeringen av et fusjonsprotein som består av forskjellige polyglutamin (CAG, Q) strekninger (Q40, Q44 og Q85). Vi illustrerer hvordan teknikken kan brukes likt på forskjellige fluoroforer, som cyanfluorescerende protein (CFP), gult fluorescerende protein (YFP) og monomeriske røde fluorescerende protein (mRFP); og i alle vev av C. elegans, inkludert nevroner, muskler, og tarmen. Videre, i sammenheng med proteostase, er FLIM et svært nyttig verktøy for å observere endringer ved uttømming av molekylære chaperons. Slå ned en av de viktigste molekylære chaperones, varme sjokk protein 1 (hsp-1), via RNA interferens produserer for tidlig feilfolding av proteiner. Økningen i aggregeringsbelastning som følge av aldring, sykdom eller mangelfulle chaperones, måles deretter som en reduksjon i fluorescens levetid.
Protokollen som presenteres her beskriver en mikroskopibasert teknikk for å identifisere aggregerte arter i C. elegans modellsystem. FLIM kan nøyaktig karakterisere tilstedeværelsen av både aggregerte og oppløselige arter smeltet til en fluorophore via måling av deres fluorescens levetid forfall. Når et fusjonsprotein begynner å aggregere sin registrerte gjennomsnittlige levetid vil skifte fra en høyere til en lavere verdi16. Tilbøyeligheten til aggregering kan deretter utledes …
The authors have nothing to disclose.
Muskel-Q40-mRFP-stammen levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Den nevronale-Q40-CFP var en snill gave av Morimoto Lab. Vi anerkjenner DFG (KI-1988/5-1 til JK, NeuroCure PhD-fellesskap av NeuroCure Cluster of Excellence til MLP), EMBO (Kortsiktig fellesskap til MLP) og Biologselskapet (reisetilskudd til CG og MLP) for finansiering. Vi anerkjenner også Advanced Light Microscopy imaging anlegget ved Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlin, for å gi oppsettet for å bilde YFP-konstruksjonene.
Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |