新しい切除された乳癌腫瘍のテラヘルツ画像化と特性化プロトコル
Summary
新しく切除されたヒト乳癌腫瘍は、新鮮な組織処理プロトコルに従ってテラヘルツ分光法およびイメージングを特徴とする。組織位置決めは、効果的な特性評価を可能にする一方、将来の術中アプリケーションに適時に分析を提供することを考慮する。
Abstract
この原稿は、パルステラヘルツイメージングと分光法を用いて、新たに切除されたヒト乳房腫瘍を処理、特徴付け、画像化するためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、通常の入射率でテラヘルツ伝送モードを使用し、30°の斜めの角度でテラヘルツ反射モードを使用します。収集された実験データは、電界の時間領域パルスを表す。切除された組織上の固定点を透過するテラヘルツ電界信号を処理し、解析モデルを介して、組織の屈折率および吸収係数を抽出する。ステッパーモータスキャナを利用して、テラヘルツ放射パルスは、異なる組織領域の平面画像を提供する腫瘍上の各ピクセルから反射される。画像は、時間または周波数領域で表示することができます。さらに、各画素における屈折率および吸収係数の抽出データは、腫瘍の断層テラヘルツ画像を提供するために利用される。このプロトコルは、癌性組織と健康組織の明確な分化を示す。一方、プロトコルに付着しないと、気泡が存在し、流体が腫瘍表面に残ることによる騒がしい画像または不正確な画像が生じる可能性があります。このプロトコルは、乳房腫瘍の外科的マージン評価のための方法を提供する。
Introduction
テラヘルツ(THz)イメージングと分光法は、過去10年間で急速に成長している研究分野です。0.1~4 THzの範囲で、より効率的で一貫性のあるTHzエミッタの開発が続く中、アプリケーションは1.THzが約束と著しい成長を示している分野の1つは、生物医学分野2である。THz放射は、固定組織3の分析に一般的に使用される電力レベルにおいて非イオン化および生物学的に安全であることが示されている。その結果、THzイメージングおよび分光法は、水分量などの様々な組織特徴を分類・分化して、火傷の損傷および治癒4、肝硬変5、および切除組織6,77における癌を示すために用いられてきた。,特に癌評価は、臨床的および外科的応用の可能性の広い範囲をカバーし、脳8、肝臓9、卵巣10、胃腸管11、および乳房7、12、13、14、15、16、17、18、1912,13,14,15,16の癌について調査されている。17,18,197
乳癌のTHzアプリケーションは、主にマージン評価を介して乳房温存手術、または乳房切除術をサポートすることに焦点を当てています。乳房全体を除去する完全乳房切除術とは対照的に、乳房切除術の目的は、腫瘍および周囲の健康な組織の小層を除去することである。切除された組織の外科的マージンは、サンプルがホルマリンに固定され、切り離され、パラフィンに埋め込まれ、顕微鏡上の4μm-5 μmのスライスに取り付けられると、病理学を介して評価されます。このプロセスは時間がかかることがあり、正のマージンが観察された場合は後で二次外科的処置が必要です。米国放射線腫瘍学会の現在のガイドラインは、この正のマージンを、表面レベルのマージンインク21に接触する癌細胞を有すると定義している。高吸収水和組織のTHzイメージングは、主に、迅速なマージン評価の外科的ニーズを満たすのに十分な組織タイプに基づいて、いくつかの様々な浸透を有する表面イメージングに限定される。外科的設定中のマージン状態の迅速な分析は、外科的費用とフォローアップ処置率を大幅に減少させるであろう。現在までに、THzはホルマリン固定、パラフィン埋め込み(FFPE)組織における癌と健康組織の区別に有効であることが証明されているが、新たに切除された組織における癌の確実な検出を提供するために追加の調査が必要である7。
このプロトコルは、バイオバンクから得られた新しい切除されたヒト組織サンプルに対してTHzイメージングおよび分光分析を行うためのステップを詳述する。切除されたばかりのヒト乳癌組織に基づいて構築されたTHzアプリケーションは、特に病院と統合されていない研究グループによって、公表された研究7,187、18、22、23ではほとんど使用されていません。,22,23切除された新しい組織の使用は、他の癌の適用にも同様にまれであり、ほとんどの非乳癌癌例は大腸癌24,25,25について報告されている。その理由の1つは、研究に使用されているTHzシステムが外科的ワークフローの一部でない限り、FFPE組織ブロックは、新たに切除された組織よりもはるかに簡単にアクセスして取り扱いやすいということです。同様に、ほとんどの市販の実験室THzシステムは、新鮮な組織を処理する準備ができておらず、細胞株の成長を使用する段階にあるか、動物モデルからの切除された組織を見始めただけです。THzを術中の設定に適用するには、分析が標準的な病理を行う能力を妨げないように、新鮮な組織のためにイメージングと特性評価のステップを事前に開発する必要があります。本来は術中を意図していないアプリケーションでは、新しい組織の特性評価は、生体内のアプリケーションと分化に向けて取り組むために取り組まなければならない困難なステップです。
この研究の目的は、商用THzシステムを使用して新しく切り出した組織のためのTHzアプリケーションのガイドラインを提供することです。このプロトコルは、マウス乳癌腫瘍13、17、19に対する19THzイメージングおよび分光法システム26上17で開発され、バイオ,バンク7、1818から得られたヒト外科7組織に拡張された。このプロトコルは乳癌に対して生成されたが、同じ概念を同様のTHz画像化システムおよび成功がマージン評価27に依存する手術で治療される他のタイプの固形腫瘍癌にも適用することができる。切除された組織に関してかなり少量のTHz結果が公表されているため、これはTHzイメージングおよび特性評価のための新鮮な組織処理のプロトコルに焦点を当てた著者の知識にとって初めての研究です。
Protocol
Representative Results
Discussion
新鮮な組織の効果的なTHz反射イメージングは、主に2つの重要な側面に依存する:1)組織処理の適切な考慮(セクション2および4.15);;2)ステージ設定(主にセクション4.11)。組織の乾燥が不十分な場合、DMEMおよび他の流体の高い反射による領域の反射および可視化ができなくなる。一方、イメージングウィンドウとの組織接触が悪いと、THz反射画像に低反射のリングまたはスポットが作成され、結果…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(NIH)賞#R15CA208798によって資金提供され、一部は国立科学財団(NSF)賞#1408007によって資金提供されました。パルスTHzシステムの資金調達は、NSF/MRIアワード#1228958を通じて得られました。我々は、NIH補助金U42OD11158の支援を受けて、国立疾病研究インターチェンジ(NDRI)によって調達された組織の使用を認める。我々はまた、この研究で取り扱われるすべての組織に対する組織病理学的処置を行ったオクラホマ州立大学のオクラホマ動物疾患診断研究所との共同研究を認める。
Materials
| 70% isopropyl alcohol | VWR | 89108-162 | Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water |
| Alconox powder detergent | VWR | 21835-032 | Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass |
| Bio Hazard Bags | Fisher Scientific | 19-033-712 | Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags |
| Cardboard holder | N/A | N/A | Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin |
| Centrifuge Tubes | VWR | 10026-078 | Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line |
| Cotton Swabs | Walmart | 551398298 | Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue |
| Ethyl Alcohol | VWR | 71002-426 | KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol |
| Eye protection goggles | VWR | 89130-918 | Kimberly-clark professional safety glasses |
| Face Mask | VWR | 95041-774 | DUKAL Corporation surgical masks |
| Filter paper | Sigma Aldrich | Z240087 | Whatman grade 1 cellulose filters |
| Formalin solution | Sigma Aldrich | HT501128-4L | 10% neutral buffered formalin |
| Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC)) | National Disease Research Interchange (NDRI biobank | N/A | A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required |
| IRADECON Bleach solution | VWR | 89234-816 | Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution |
| KIMTECH SCIENCE wipes | VWR | 21905-026 | Kimberly-clark professional Kim wipes |
| Laboratory Coat | VWR | 10141-342 | This catalog number is for medium size coat |
| Laboratory tweezers/Forceps | VWR | 82027-388 | Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue |
| Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer) | TeraView, Ltd | N/A | 1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows |
| Nitrile hand gloves | VWR | 82026-426 | This catalog number is for medium size gloves |
| Nitrogen cylinder | Airgas | NI UHP300 | NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300 |
| Paper towel | VWR | 14222-321 | 11 x 8.78" Sheets, 1 Ply |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion. |
| Petri Dish | VWR | 470210-568 | VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom) |
| Polystyrene Plate | Home Depot | 1S11143A | ~ 10 x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet |
| ScanAcquire Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz reflection imaging measurements |
| Stainless steel low-profile blade (#4689) | VWR | 25608-964 | Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades |
| Stainless steel metal tray | Quick Medical | 10F | Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays |
| Tissue Marking Dyes | Ted Pella, Inc | Yellow Dye #27213-1 Red Dye #27213-2 Blue Dye #27213-4 |
Used to orient excised tissue samples sent to the histopathology laboratory |
| TPS Spectra 3000 | TeraView, Ltd | N/A | THz imaging and spectroscopy system |
| TPS Spectra Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz transmission spectroscopy measurements |
References
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