Nyligen strukits mänskliga bröstcancer tumörer kännetecknas med terahertz spektroskopi och bildbehandling efter färsk vävnad hantering protokoll. Vävnadspositionering beaktas för att möjliggöra effektiv karakterisering samtidigt som analys i tid för framtida intraoperativa tillämpningar.
Detta manuskript presenterar ett protokoll för att hantera, karakterisera och bild nyligen strukits mänskliga bröst tumörer med pulsade terahertz imaging och spektroskopi tekniker. Protokollet innebär terahertz transmissionsläge vid normal incidens och terahertz reflektionsläge i en sned vinkel på 30°. De insamlade experimentella data representerar tiddomänpulser i det elektriska fältet. Terahertz elektriska fältsignal som överförs genom en fast punkt på den strukna vävnaden bearbetas genom en analytisk modell för att extrahera brytningsindex och absorptionskoefficienten i vävnaden. Med hjälp av en stepper motor scanner, terahertz avges puls reflekteras från varje pixel på tumören ger en plana bild av olika vävnadsregioner. Bilden kan visas i tid eller frekvensdomän. Dessutom används de extraherade data av brytningsindex och absorptionskoefficienten vid varje pixel för att ge en tomographic terahertz bild av tumören. Protokollet visar tydlig differentiering mellan cancerogena och friska vävnader. Å andra sidan, inte följa protokollet kan resultera i bullriga eller felaktiga bilder på grund av närvaron av luftbubblor och vätska kvar på tumörytan. Protokollet ger en metod för kirurgiska marginaler bedömning av brösttumörer.
Terahertz (THz) bildbehandling och spektroskopi har varit ett snabbt växande forskningsområde under det senaste decenniet. Den fortsatta utvecklingen av effektivare och mer konsekventa THz-utsläppskällor i intervallet 0,1–4 THz har fått deras tillämpningar att växa betydligt1. Ett område där THz har visat lovande och betydande tillväxt är det biomedicinska fältet2. THz-strålning har visat sig vara nonioniserande och biologiskt säker vid de effektnivåer som vanligtvis används för att analysera fasta vävnader3. Som ett resultat, THz imaging och spektroskopi har använts för att klassificera och differentiera olika vävnadsfunktioner såsom vattenhalt för att indikera brännskador och helande4,levercirros5, och cancer i strukna vävnader6,7. Cancerbedömning i synnerhet omfattar ett brett spektrum av potentiella kliniska och kirurgiska tillämpningar, och har undersökts för cancer i hjärnan8, lever9, äggstockarna10,mag-tarmkanalen11, och bröst7,12,13,14,15,16,17,18,19.
THz applikationer för bröstcancer är främst inriktade på att stödja bröst spara kirurgi, eller lumpectomy, via marginal bedömning. Målet med en lumpectomy är att ta bort tumören och ett litet lager av omgivande frisk vävnad, i motsats till full mastektomi, som tar bort hela bröstet. Den kirurgiska marginalen för den strukna vävnaden bedöms sedan via patologi när provet har fastställts i formalin, snittas, inbäddad i paraffin och monteras i 4 μm-5 μm skivor på mikroskop diabilder. Denna process kan vara tidskrävande och kräver ett sekundärt kirurgiskt ingrepp vid ett senare tillfälle om en positiv marginal observeras20. Nuvarande riktlinjer från American Society of Radiation Oncology definiera denna positiva marginal som att ha cancerceller som kontaktar ytan-nivå marginal bläck21. THz imaging för hög absorption hydrerad vävnad är främst begränsad till ytavbildning med viss varierande penetration baserat på vävnadstyp, vilket är tillräckligt för att möta de kirurgiska behoven av snabb marginalbedömning. En snabb analys av marginalen villkor under kirurgiska inställningen skulle kraftigt minska kirurgiska kostnader och uppföljning förfarande takt. Hittills har THz visat sig vara effektivt för att skilja mellan cancer och frisk vävnad i formalin-fasta, paraffin-inbäddade (FFPE) vävnader, men ytterligare undersökning behövs för att ge tillförlitlig upptäckt av cancer i nyligen strukna vävnader7.
Detta protokoll beskriver stegen för att utföra THz-avbildning och spektroskopi på nyligen strukna mänskliga vävnadsprover som erhållits från en biobank. THz applikationer byggda på nyligen strukna mänskliga bröstcancer vävnader har sällan använts i publicerad forskning7,18,22,23, särskilt av forskargrupper som inte är integrerade med ett sjukhus. Användningen av nyligen strukna vävnader är också sällsynt för andra cancer applikationer, med de flesta icke-bröstcancer exempel rapporteras för tjocktarmscancer24,25. En anledning till detta är att FFPE vävnadsblock är mycket lättare att komma åt och hantera än nyligen struken vävnad om inte THz-systemet som används för studien är en del av det kirurgiska arbetsflödet. På samma sätt är de flesta kommersiella laboratorie-THz-system inte beredda att hantera färsk vävnad, och de som gör är fortfarande i de stadier av att använda celllinjen tillväxt eller har bara börjat titta på struken vävnad från djurmodeller. För att tillämpa THz på en intraoperativ inställning krävs att bild- och karakteriseringssteg utvecklas för färsk vävnad i förväg så att analysen inte stör förmågan att utföra vanlig patologi. För applikationer som inte är avsedda att vara intraoperativ, karakterisering av färsk vävnad är fortfarande ett utmanande steg som måste åtgärdas för att arbeta mot in vivo applikationer och differentiering.
Syftet med detta arbete är att tillhandahålla en riktlinje för THz-tillämpning för nystruken vävnad med hjälp av ett kommersiellt THz-system. Protokollet har utvecklats på en THz imaging och spektroskopi system26 för murine bröstcancer tumörer13,17,19 och utvidgades till mänsklig kirurgisk vävnad som erhållits från biobanker7,18. Medan protokollet genererades för bröstcancer, samma begrepp kan tillämpas på liknande THz bildsystem och andra typer av solid-tumör cancer som behandlas med kirurgi där framgång beror på marginal bedömning27. På grund av en ganska liten mängd publicerade THz resultat på nyligen strukna vävnader, detta är det första arbetet med författarnas kunskap att fokusera på protokollet för färsk vävnad hantering för THz imaging och karakterisering.
Effektiv THz reflektion bildbehandling av färsk vävnad är främst beroende av två kritiska aspekter: 1) korrekt hänsyn till vävnadshantering (avsnitten 2 och 4,15); och 2) sceninställningen (i första hand avsnitt 4.11). Otillräcklig torkning av vävnaden kan resultera i ökad reflektion och oförmåga att visualisera regioner på grund av höga reflektioner av DMEM och andra vätskor. Samtidigt skapar dålig vävnadskontakt med bildfönstret ringar eller fläckar av låg reflektion i THz reflektionsbild som skym…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health (NIH) Award # R15CA208798 och delvis av National Science Foundation (NSF) Award # 1408007. Finansiering för det pulsade THz-systemet erhölls genom NSF/MRI Award # 1228958. Vi erkänner användningen av vävnader som upphandlas av National Disease Research Interchange (NDRI) med stöd från NIH-bidraget U42OD11158. Vi erkänner också samarbetet med Oklahoma Animal Disease Diagnostic Laboratory vid Oklahoma State University för att genomföra histopathology förfarandet på alla vävnader som hanteras i detta arbete.
70% isopropyl alcohol | VWR | 89108-162 | Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water |
Alconox powder detergent | VWR | 21835-032 | Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass |
Bio Hazard Bags | Fisher Scientific | 19-033-712 | Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags |
Cardboard holder | N/A | N/A | Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin |
Centrifuge Tubes | VWR | 10026-078 | Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line |
Cotton Swabs | Walmart | 551398298 | Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue |
Ethyl Alcohol | VWR | 71002-426 | KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol |
Eye protection goggles | VWR | 89130-918 | Kimberly-clark professional safety glasses |
Face Mask | VWR | 95041-774 | DUKAL Corporation surgical masks |
Filter paper | Sigma Aldrich | Z240087 | Whatman grade 1 cellulose filters |
Formalin solution | Sigma Aldrich | HT501128-4L | 10% neutral buffered formalin |
Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC)) | National Disease Research Interchange (NDRI biobank | N/A | A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required |
IRADECON Bleach solution | VWR | 89234-816 | Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution |
KIMTECH SCIENCE wipes | VWR | 21905-026 | Kimberly-clark professional Kim wipes |
Laboratory Coat | VWR | 10141-342 | This catalog number is for medium size coat |
Laboratory tweezers/Forceps | VWR | 82027-388 | Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue |
Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer) | TeraView, Ltd | N/A | 1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows |
Nitrile hand gloves | VWR | 82026-426 | This catalog number is for medium size gloves |
Nitrogen cylinder | Airgas | NI UHP300 | NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300 |
Paper towel | VWR | 14222-321 | 11 x 8.78" Sheets, 1 Ply |
Parafilm | VWR | 52858-076 | Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion. |
Petri Dish | VWR | 470210-568 | VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom) |
Polystyrene Plate | Home Depot | 1S11143A | ~ 10 x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet |
ScanAcquire Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz reflection imaging measurements |
Stainless steel low-profile blade (#4689) | VWR | 25608-964 | Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades |
Stainless steel metal tray | Quick Medical | 10F | Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays |
Tissue Marking Dyes | Ted Pella, Inc | Yellow Dye #27213-1 Red Dye #27213-2 Blue Dye #27213-4 |
Used to orient excised tissue samples sent to the histopathology laboratory |
TPS Spectra 3000 | TeraView, Ltd | N/A | THz imaging and spectroscopy system |
TPS Spectra Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz transmission spectroscopy measurements |