Analyse de cytométrie de flux des sous-ensembles de cellules immunitaires dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial dans un modèle d’arthrose

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole détaillé et reproductible de cytométrie de flux pour identifier les sous-ensembles monocytes/macrophage et t-cell utilisant des essais de coloration extra- et intracellulaire dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial, utilisant un modèle chirurgical établi de l’arthrose murine.

Résumé

L’arthrose est l’une des maladies musculo-squelettiques les plus répandues, affectant les patients souffrant de douleur et de limitations physiques. Des preuves récentes indiquent un composant inflammatoire potentiel de la maladie, avec les cellules T et les monocytes/macrophages potentiellement associés à la pathogénie de l’OA. D’autres études ont postulé un rôle important pour des sous-ensembles des deux lignées cellulaires inflammatoires, telles que Th1, Th2, Th17, et lymphocytes T-régulateurs, et M1, M2, et synovium-tissu-résidents macrophages. Cependant, l’interaction entre la réponse cellulaire inflammatoire synoviale et systémique locale et les changements structurels dans l’articulation est inconnue. Pour bien comprendre comment les lymphocytes T et les monocytes/macrophages contribuent à l’arthrose, il est important de pouvoir identifier ces cellules et leurs sous-ensembles simultanément dans les tissus synoviaux, les organes lymphatiques secondaires et systémiquement (la rate et la moelle osseuse). De nos jours, les différents sous-ensembles de cellules inflammatoires peuvent être identifiés par une combinaison de marqueurs de surface cellulaire faisant de la cytométrie de flux multicolore une technique puissante dans l’étude de ces processus cellulaires. Dans ce protocole, nous décrivons des étapes détaillées concernant la récolte du tissu synovial et des organes lymphatiques secondaires ainsi que la génération de suspensions unicellulaires. En outre, nous présentons à la fois un test de coloration extracellulaire pour identifier les monocytes/macrophages et leurs sous-ensembles aussi bien qu’un test de coloration extra- et intra-cellulaire pour identifier les lymphocytes T et leurs sous-ensembles dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial. Chaque étape de ce protocole a été optimisée et testée, ce qui a donné lieu à un test hautement reproductible qui peut être utilisé pour d’autres modèles chirurgicaux et non chirurgicaux de souris OA.

Introduction

L’arthrose (OA) est une maladie débilitante et douloureuse impliquant diverses pathologies de tous les tissus associés à l’articulation¹. Affectant environ 3,8% de la population mondiale², l’arthrose est l’une des maladies musculo-squelettiques les plus répandues et elle deviendra la^4ème cause d’invalidité dans le monde d’ici 2020³. L’arthrose post-traumatique survient après une blessure articulaire et représente au moins 12 % de l’ensemble de l’arthrose et jusqu’à 25 % de l’arthrose dans les articulations sensibles comme le genou^4,,5....

Protocole

Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee a approuvé toutes les procédures mentionnées dans ce protocole. Les souris sont logées et soignées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Pour toutes les expériences 10-12-semaine-vieux, mâle C57BL/6 souris ont été utilisées.

REMARQUE : Pour induire l’OA post-traumatique, la déstabilisation chirurgicale du ménisque médial (DMM) dans l’articulation d’étouffement droite a été exécutée. Des informations détaillées concernant ce modèle animal ont été publiées par Glass....

Résultats

Les résultats représentatifs du panneau de sous-ensemble de monocytes et du panneau de sous-ensemble de cellules T sont décrits ci-dessous.

La figure 1 illustre la stratégie hiérarchique de gating pour le panneau de sous-ensemble de monocytes sur les cellules immunitaires recueillies à partir de la moelle osseuse des animaux traités par DMM. La même stratégie a été utilisée et vérifiée dans tous les autres types de tissus. Lors de la mise en place de l’expérience,.......

Discussion

Les méthodes décrites dans ce protocole ont été conçues et testées pour identifier de manière fiable divers sous-ensembles des monocytes/macrophages et des lymphocytes T dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques, et le tissu synovial dans un modèle murin de l’arthrose (OA). Le protocole actuel peut facilement être modifié pour étudier différents types de tissus, ou d’autres types de cellules en échangeant des anticorps, et peut être utilisé pour d’autres modèles muriniques de l’arthrose. Lors de .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
APC anti-souris CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	T-Cell
Panel Tampon de Teinture Brillant Plus 1000Tst	BD	566385	Tampons
De Viabilité Fixable Teinture 510, 100 µ ; g	BD	564406	Panneau T-Cell
Fixable Vitability Stain 510, 100 & micro ; g	BD	564406	Monocyte
Panel Liberase, Research Grade	Roche	5401127001	Enzyme pour le tissu synovial
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 & micro ; g	BD	564985	Panneau monocytaire
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µ ; g	BD	562454	Panneau Monocyte
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µ ; g	Panneau T BD	742274
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µ ; g	BD	565250	Panneau monocytaire
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µ ; g	BD	563061	Panneau T-Cell
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 & micro ; g	BD	557596	Panneau T-Cell
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 & micro ; g	Panneau à	cellules T	552775
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 & micro ; g	BD	565480	Panneau T-Cell
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µ ; g	Panneau T BD	565261
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 & micro ; g	BD	740664	Panneau T-Cell
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 & micro ; g	BD	563687	Panneau monocytaire
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 & micro ; g	BD	563332	Panneau T-Cell
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 & micro ; g	BD	565411	Panneau monocytaire
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µ ; g	BD	560408	Panneau T-Cell
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µ ; g	BD	563414	Panneau Monocyte
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µ ; g	BD	560593	Panneau monocytaire
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µ ; g	BD	560600	Panneau monocyte
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µ ; g	BD	564143	Panneau T-Cell
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µ ; g	BD	562894	T-Cell Panel
Tampon de lyse des globules rouges	/A	Tampons	/A
Tampons de facteur de transcription 100Tst	BD	562574	Buffers

BD NN