تحريض الخلايا اللبتومينينالتي تعديل عن طريق الحقن داخل الجمجمة
Summary
نحن نصف حقن داخل الجمجمة التي تستخدم إبرة عازمة في الطرف التي يمكن تثبيتها في الجمجمة، وبالتالي القضاء على خطر تلف parenchyma الكامنة. ويمكن استخدام هذا النهج لرسم خرائط المصير الوراثي والتلاعب في الخلايا اللولبية وتتبع حركة السائل النخاعي.
Abstract
يصف البروتوكول المبين هنا كيفية حقن الحلول بأمان ويدويًا من خلال الصهريج ماجنا مع القضاء على خطر تلف parenchyma الأساسية. توصي البروتوكولات المنشورة سابقًا باستخدام إبر مستقيمة يجب خفضها إلى 1-2 مم كحد أقصى من سطح الدورة. إن الانخفاض المفاجئ في المقاومة بمجرد ثقب الغشاء الجافي يجعل من الصعب الحفاظ على الإبرة في وضع ثابت. بدلا ً من ذلك، تستخدم طريقتنا إبرة منحنية عند الطرف الذي يمكن تثبيته ضد العظم القذالي للجمجمة، وبالتالي منع الحقنة من اختراق الأنسجة بعد تعامس الغشاء الجاف. الإجراء بسيط وقابل للتكرار ولا يسبب إزعاجًا طويل الأمد في الحيوانات التي يتم تشغيلها. نحن نصف استراتيجية الحقن داخل الجمجمة في سياق رسم خرائط المصير الوراثي للخلايا اللبتومينينجية الوعائية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام نفس التقنية لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة البحثية، مثل التحقيق في دور اللبتومينينج في التنمية العصبية وانتشار التهاب السحايا البكتيري، من خلال الاستئصال الوراثي للجينات المتورطة بشكل مفترض في هذه الظواهر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج الإجراء مع نظام ضخ آلي للتسليم المستمر واستخدامه لتتبع حركة السائل النخاعي عن طريق حقن الجزيئات الموسومة بفلورية.
Introduction
الخلايا الليبومينينجية هي مجموعة تشبه الخلايا الليفية من الخلايا المنظمة في طبقة رقيقة تتراكب في الدماغ وتعبر عن الجينات المتورطة في ربط الكولاجين (على سبيل المثال، Dcn و Lum)،وفي إنشاء حاجز في الدماغ بيننجيال (على سبيل المثال، Cldn11)1،2. الخلايا اللبتومينينجية متورطة في مجموعة واسعة من الوظائف الفسيولوجية، من الرقابة الصارمة على تصريف السائل النخاعي3 إلى توجيه السلف العصبي في الدماغالنامية 4,5. وقد اقترحت دراسة حديثة أيضا أن اللبتومينينجيات في حديثي الولادة قد تؤوي الخلايا شعاعية مثل غليا التي تهاجر إلى parenchyma الدماغ وتتطور إلى الخلايا العصبية القشرية وظيفية6.
وتقع الخلايا اللبتومينينجيال على مقربة من الخلايا الفلكية السطحية ومشاركتها معهم، فضلا عن استروجليا parenchymal الأخرى، والتعبير عن connexin-30 (Cx30)7. يسمح الإجراء الجراحي المبين أدناه بوضع علامات واسعة النطاق ومحددة لهذه الخلايا الرجالية عبر تسليم الإندوكسيفين لمرة واحدة في الصهريج ماجنا من الفئران المعدلة وراثياً معبرة بشكل مشروط عن tdTomato في Cx30+ الخلايا (أي باستخدام نظام CreER-loxP لرسم خرائط المصير). Endoxifen هو المستقلب النشط من تاموكسيفين ويحفز إعادة تركيب الخلايا التعبير ية عن CreER بنفس الطريقة التي يفعل تاموكسيفين. ومع ذلك ، فمن الحل الموصى به للتطبيق الموضعي لأنه يذوب في 5-10 ٪ DMSO ، بدلا من تركيزات عالية من الإيثانول. بالإضافة إلى ذلك ، لا يعبر endoxifen حاجز الدماغ meningeal ، وبالتالي تمكين إعادة تركيب محددة من الخلايا اللولبية ، دون وضع علامات على السكان Cx30+ astroglial الأساسية (انظر النتائج التمثيلية).
تهدف التقنية المعروضة هنا إلى حقن المركب يدويًا وبأمان في السائل النخاعي ، عبر الوصول المباشر إلى الصهريج ماجنا. على عكس الإجراءات الأخرى الأكثر توغلًا التي تتطلب عملية جراحية في القحف ، يسمح هذا النهج بغرس المركبات دون التسبب في تلف الجمجمة أو parenchyma في الدماغ. وبالتالي ، فإنه لا يرتبط مع تحريض ردود الفعل الالتهابية الناجمة عن تنشيط خلايا غليا parenchymal. على غرار استراتيجيات الحقن الأخرى الموصوفة قبل8,9,10, يعتمد النهج الحالي على التعرض الجراحي لغشاء الدورة القذالي atlanto الذي يغطي الصهريج ماجنا , بعد تشريح حاد لعضلات الرقبة المتراكبة. ومع ذلك ، على عكس الإجراءات الأخرى ، نوصي باستخدام إبرة عازمة عند الطرف ، والتي يمكن تثبيتها ضد العظام القذالية أثناء الإدارة. وهذا سيمنع خطر اختراق الإبرة عميقة جدا وإتلاف المخيخ الكامنة والنخاع.
هذا الإجراء الجراحي متوافق مع تحقيقات تتبع النسب التي تهدف إلى رسم خرائط التغيرات في هويات الخلايا وطرق الهجرة من خلال طبقات parenchymal. كما يمكن تكييفه مع دراسات الاستئصال الوراثية التي تهدف إلى التحقيق في دور الخلايا اللبتومينينجية في الصحة والمرض ، مثل مساهمتها في التنمية القشرية5 أو انتشار التهاب السحايا البكتيري3،11. وأخيرا، يمكن استخدامه لتتبع حركة السائل النخاعي عندما يقترن تسليم التراصد الفلوري في الحيوانات البرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المبين هنا يقدم إجراء مباشر واستنساخ لتسمية الخلايا اللولبية لرسم خرائط المصير. نحن نستخدم حقن intracisternal من endoxifen، المستقلب النشط من تاموكسيفين، للحث على التعبير عن مراسل tdTomato الفلورسنت في Cx30-CreER. R26R-tdTomato الفئران12,13.
بالمقارنة مع ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة منح من مجلس البحوث السويدي، والجمعية السويدية للسرطان، والمؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية، وكنوت أوتش أليس والينبرغر ستفيلس، وبرنامج البحوث الاستراتيجية في الخلايا الجذعية والطب التجديدي في معهد كارولينسكا (ستراتريجين).
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).
- Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
- Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
- Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
- Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
- Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
