Detektion av Protein S-Acylation med Acyl-Harts Assisted Capture
Summary
Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) är en mycket känslig, tillförlitlig och lätt att utföra metod för att upptäcka reversibel lipidmodifiering av cysteinrester (S-acylation) i en mängd olika biologiska prover.
Abstract
Protein S-acylation, även kallad S-palmitoylering, är en reversibel post-translationell modifiering av cysteinrester med långkedjiga fettsyror via en labile tiooter bindning. S-acylation, som håller på att växa fram som en utbredd regleringsmekanism, kan modulera nästan alla aspekter av proteinernas biologiska aktivitet, från komplex bildning till proteinhandel och proteinstabilitet. Den senaste tidens framsteg i förståelsen av proteinets biologiska funktion S-acylation uppnåddes till stor del på grund av utvecklingen av nya biokemiska verktyg som möjliggör robust och känslig detektion av protein S-acylation i en mängd olika biologiska prover. Här beskriver vi acyl harts-assisted capture (Acyl-RAC), en nyligen utvecklad metod baserad på selektiv fångst av endogent S-acylated proteiner av tiool-reaktiva Sepharose pärlor. Jämfört med befintliga metoder kräver Acyl-RAC färre steg och kan ge mer tillförlitliga resultat i kombination med masspektrometri för identifiering av nya S-acylation mål. En stor begränsning i denna teknik är bristen på förmåga att diskriminera mellan fettsyra arter knutna till cysteiner via samma tiode bond.
Introduction
S-acylation är en reversibel post-translationell modifiering som innebär tillsats av en fet acylkedja till en intern cystein rester på ett målprotein via en labile tiooter bindning1. Det rapporterades först som en ändring av proteiner med palmitat, en mättad 16-kolfettsyra2, och därför denna ändring kallas ofta S-palmitoylation. Förutom palmitat kan proteiner vördas av en mängd längre och kortare mättade (myristate och stearate), enkelomättade (oleat) och fleromättade (arachidonate och eicosapentanoate) fettsyror3,,4,,5,,6,7. I eukaryota celler, S-acylation katalyseras av en familj av enzymer som kallas DHHC protein acyltransferases och den omvända reaktionen av cystein deacylation är katalyserad av protein tioesteraser, varav de flesta fortfarande gåtfulla8.
Labiliteten hos tioesterbindningen gör denna lipidmodifiering reversibel, vilket gör det möjligt att dynamiskt reglera proteinkluster, plasmamembranlokalisering, intracellulär handel, protein-proteininteraktioner och proteinstabilitet9,10. Följaktligen har S-acylation kopplats till flera sjukdomar inklusive Huntingtons sjukdom, Alzheimers sjukdom och flera typer av cancer (prostata, mag, urinblåsa, lunga, kolorektal), vilket kräver utveckling av tillförlitliga metoder för att upptäcka denna post-translationella protein modifiering11.
Metabolisk märkning med radioaktiv ([3H], [14C] eller [125I]) palmitat var en av de första metoder som utvecklats för att analysera proteinet S-acylation12,13,14. Men radiolabeling-baserade metoder presentera hälsoproblem, är inte särskilt känsliga, tidskrävande, och bara upptäcka lipidering av mycket rikliga proteiner15. Ett snabbare och icke-radioaktivt alternativ till radiomärkning är metabolisk märkning med bioorthogonala fettsyror sonder, som används rutinmässigt för att analysera dynamiken i proteinet S-acylation16. I denna metod, en fettsyra med en kemisk reporter (alkyne eller azide grupp) ingår i S-acylaterade proteinet av ett protein acyltransferase. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reaktion (klicka kemi) kan sedan användas för att fästa en funktionaliserad grupp, såsom en fluorofore eller biotin, till den integrerade fettsyran möjliggör detektion av S-acylated protein17,18,19.
Acyl-biotin utbyte (ABE) är en av de omfattande använda biokemiska metoder för avskiljning och identifiering av S-acylaterade proteiner som kringgår några av bristerna i metabolisk märkning såsom olämplighet för vävnadsprover15. Denna metod kan användas för analys av S-acylation i ett varierat antal biologiska prover, inklusive vävnader och frysta cellprover20,21. Denna metod är baserad på selektiv klyvning av tioesterbindningen mellan acylgruppen och cysteinresterna genom neutral hydroxylamin. De befriade tioolgrupperna fångas sedan med ett tioolreaktivt biotinderivat. De genererade biotinylerade proteinerna renas sedan med hjälp av streptavidin agarose och analyseras genom immunoblotting.
En alternativ metod som kallas acyl-harts assisterad fångst (Acyl-RAC) infördes senare för att ersätta biotinylation steg med direkt konjugering av fria cysteiner med en tiool-reaktiv harts22,23. Denna metod har färre steg jämfört med ABE och på samma sätt kan användas för att upptäcka protein S-acylation i ett brett spektrum av prover1.
Acyl-RAC består av 4 huvudsteg (figur 1),
1. Blockering av fria tioolgrupper.
2. Selektiv klyvning av cystein-acyl tioesterbindning med neutral hydroxylamin (HAM) för att exponera cysteintiosgrupper.
3. Fånga av lipiderade cysteiner med en tioolreaktiv harts;
4. Selektiv anrikning av S-acylaterade proteiner efter eluering med reducerande buffert.
De fångade proteinerna kan sedan analyseras genom immunblottning eller utsättas för masspektrometri (MS) baserade proteomik för att bedöma S-acylaterad proteom i ett varierat antal arter och vävnader22,24,25. Enskilda S-acylation platser kan också identifieras genom trypsin matsmältningen av de fångade proteinerna och analys av de resulterande peptiderna av LC-MS/MS22. Här visar vi hur acyl-RAC kan användas för samtidig detektion av S-acylation av flera proteiner i både en cellinje och ett vävnadsprov.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi framgångsrikt utnyttjat acyl-RAC-analysen för att upptäcka S-acylation av utvalda proteiner i både odlade mänskliga celler och primära celler som härrör från musvävnad. Denna metod är enkel, känslig och kan enkelt utföras med minimala utrustningskrav med hjälp av standardbiokemitekniker. Denna metod har visat sig framgångsrikt identifiera nya S-acylaterade proteiner såsom β-underenheten i proteinflyttningssystemet (Sec61b), ribosomalt protein S11 (Rps11) och microsomal glutation-S-tr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health grants 5R01GM115446 och 1R01GM130840.
Materials
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
References
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).
- Fujimoto, T., et al. P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage. Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).
- DeMar, J. C., Anderson, R. E. Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver. Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).
- Montigny, C., et al. S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin. Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).
- Muszbek, L., Laposata, M. Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets. Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).
- Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
- Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206 (2008).
- Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids. Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).
- Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck. Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).
- Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein Palmitoylation database. F1000Research. 4, 1-23 (2015).
- O’Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
- Drahansky, M., et al. We are IntechOpen , the world’s leading publisher of Open Access books Built by scientists. Intech. 13, (2016).
- Resh, M. D. Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation. Methods. 40 (2), 191-197 (2006).
- Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
- Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6, 135-138 (2009).
- Rami, N., Hannoush, N. A. -. R. Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins. ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).
- Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
- Charron, G., et al. Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
- Roth, A. F., et al. Global analysis of protein palmitoylation in yeast. Cell. 125, 1003-1013 (2006).
- Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).
- Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
- Guo, J., et al. Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
- Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).
- Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and activation of murine lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).
- Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative “null” and “T” cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).
- Hundt, M., et al. Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells. Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).
- Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).
- Brdicka, T., et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).
- Akimzhanov, A. M., Boehning, D. Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).
- Stetsenko, A., Guskov, A. An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization. Crystals. 7 (7), (2017).
- Adibekian, A., et al. Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2). Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).
- Dekker, F. J., et al. Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling. Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).
- Zhou, B., et al. Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis. Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).
