Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analys för kvantitativ bestämning av palmitolerisering av hjärnans membranproteiner
Summary
Palmitolerisering innebär införlivande av en 16-karbon palmitat moiety till cysteinrester av målproteiner på ett reversibelt sätt. Här beskriver vi en biokemisk metod, acyl-PEGyl utbyte gel skift (APEGS) analys, att undersöka palmitoylering tillstånd av något protein av intresse för mus hjärnan lysates.
Abstract
Aktivitetsberoende förändringar i nivåerna av synaptiska AMPA-receptorer (AMPARs) inom den postsynaptiska densiteten (PSD) tros representera en cellulär mekanism för inlärning och minne. Palmitolering reglerar lokalisering och funktion av många synaptiska proteiner inklusive AMPA-Rs, hjälpfaktorer och synaptiska byggnadsställningar på ett aktivitetsberoende sätt. Vi identifierade synaps differentiering inducerad gen (SynDIG) familj av fyra gener (SynDIG1-4) kodning hjärnan-specifika transmembrane proteiner som associerar med AMPARs och reglera synaps styrka. SynDIG1 är palmitoylerad vid två cysteinrester belägna vid positionerna 191 och 192 i regionen juxta-transmembrane som är viktig för verksamhetsberoende excitatorisk synapsutveckling. Här beskriver vi en innovativ biokemisk metod, acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) analys, att undersöka palmitolering tillstånd av något protein av intresse och visa dess nytta med SynDIG familj av proteiner i mus hjärnan lysates.
Introduction
S-palmitoylation är en reversibel post-translationell modifiering av målproteiner som reglerar stabil membranassociation, proteinhandel och protein-proteininteraktioner1. Det innebär tillsats av en 16-kol palmitat moiety till cystein rester via thioester länkage katalyseras av palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymer. Många synaptiska proteiner i hjärnan är palmitoylerade, inklusive AMPA-Rs och PSD-95, på ett aktivitetsberoende sätt att reglera stabilitet, lokalisering och funktion2,3,4. Förändringar i nivåerna av synaptiska AMPARs i PSD via interaktion av hjälpfaktorer med synaptiska byggnadsställningar såsom PSD-95 ligger till grund för synaptisk plasticitet; Således ger metoder för att bestämma palmitoleriseringstillståndet hos synaptiska proteiner viktig insikt i mekanismer för synaptisk plasticitet.
Tidigare har vi identifierat SynDIG-familjen av fyra gener (SynDIG1-4) kodande hjärnspecifika transmembranproteiner som associerar med AMPARs5. Överuttryck eller knock-down av SynDIG1 i dissocierade råtta hippocampus nervceller ökar eller minskar, respektive, AMPA-R synaps storlek och antal med ~ 50% som detekteras med hjälp av immuncytokemi och elektrofysiologi5. Vi använde acyl-biotin utbyte (ABE) analys för att visa att SynDIG1 är palmitoylerade vid två bevarade juxta-transmembrane Cys rester (finns i alla SynDIG proteiner) på ett verksamhetsberoende sätt att reglera stabilitet, lokalisering och funktion6. ABE-analysen bygger på utbyte av biotin mot cysteiner som skyddas genom modifiering och efterföljande rening av affinitet7. Här beskriver vi en innovativ biokemisk metod, acyl-PEGyl utbyte gel skift (APEGS) analys8,9,10,11,12, som inte kräver affinitet rening och i stället använder förändringar i gel rörlighet för att bestämma antalet ändringar för ett protein av intresse. Protokollet beskrivs för undersökning av endogena membranproteiner från mushjärna för vilka lämpliga antikroppar finns tillgängliga.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vårt tidigare arbete använde vi ABE-analysen för att visa att SynDIG1 är palmitoylerat vid två bevarade juxta-transmembrane Cys rester (finns i alla SynDIG-proteiner) på ett aktivitetsberoende sätt för att reglera stabilitet, lokalisering och funktion6. En begränsning är att ABE-analysen kräver affinitetsrening med agarose hartser konjugerade till avidin moieties som det sista steget i förfarandet, vilket resulterar i betydande förlust av signal som komplicerar kvantitativ analys. D…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar K. Woolfrey för råd och input på APEGS-analysen. Dessa studier finansierades genom forskningsanslag till E.D. från Whitehall Foundation och NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
