Palmitoylation innebærer inkorporering av en 16-karbon palmitat moiety til cystein rester av målproteiner på en reversibel måte. Her beskriver vi en biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse, for å undersøke palmitoylering tilstand av ethvert protein av interesse for mus hjernen lysates.
Aktivitetsavhengige endringer i nivåene av synaptiske AMPA-reseptorer (AMPARs) innenfor den postsynaptiske tettheten (PSD) antas å representere en cellulær mekanisme for læring og minne. Palmitoylation regulerer lokalisering og funksjon av mange synaptiske proteiner, inkludert AMPA-Rs, hjelpefaktorer og synaptiske stillas på en aktivitetsavhengig måte. Vi identifiserte synapsedifferensieringsindusertgen (SynDIG) av fire gener (SynDIG1-4) koding hjernespesifikke transmembrane proteiner som forbinder med AMPARs og regulerer synapsestyrke. SynDIG1 er palmitoylated ved to cysteinrester som ligger i stillinger 191 og 192 i den juxta-transmembrane regionen viktig for aktivitetsavhengig spenningssynapse utvikling. Her beskriver vi en innovativ biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse, for å undersøke palmitoylering tilstand av noe protein av interesse og demonstrere sin nytte med SynDIG familien av proteiner i mus hjernen lysates.
S-palmitoylering er en reversibel post-translasjonell modifikasjon av målproteiner som regulerer stabil membranforening, proteinhandel og proteinproteininteraksjoner1. Det innebærer tillegg av en 16-karbon palmitat moiety til cystein rester via thioester linkage katalysert av palmitoyl acyltransferase (PAT) enzymer. Mange synaptiske proteiner i hjernen er palmitoylert, inkludert AMPA-Rs og PSD-95, på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering og funksjon2,3,4. Endringer i nivåene av synaptiske AMPARs i PSD via interaksjon av hjelpefaktorer med synaptiske stillas som PSD-95 ligger til grunn for synaptisk plastisitet; dermed gir metoder for å bestemme palmitoyleringstilstanden til synaptiske proteiner viktig innsikt i mekanismer for synaptisk plastisitet.
Tidligere identifiserte vi SynDIG-familien med fire gener (SynDIG1-4) koding av hjernespesifikke transmembranproteiner som forbinder med AMPARs5. Overexpression eller knock-down av SynDIG1 i dissosierte rotte hippocampal nevroner øker eller reduseres, henholdsvis AMPA-R synapse størrelse og nummer med ~ 50% som detektert ved hjelp av immuncytokjemi og elektrofysiologi5. Vi benyttet acyl-biotin utveksling (ABE) analyse for å vise at SynDIG1 er palmitoylated på to konserverte juxta-transmembrane Cys rester (finnes i alle SynDIG proteiner) på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering, og funksjon6. ABE-analysen er avhengig av utveksling av biotin på cysteiner beskyttet av modifikasjon og påfølgende affinitetsrensing7. Her beskriver vi en innovativ biokjemisk tilnærming, acyl-PEGyl utveksling gel skift (APEGS) analyse8,9,10,11,12, som ikke krever affinitet rensing og i stedet benytter endringer i gel mobilitet for å bestemme antall modifikasjoner for et protein av interesse. Protokollen er beskrevet for undersøkelse av endogene membranproteiner fra musehjernen som egnede antistoffer er tilgjengelige for.
I vårt tidligere arbeid benyttet vi ABE-analysen til å vise at SynDIG1 er palmitoylated ved to konserverte juxta-transmembrane Cys rester (finnes i alle SynDIG proteiner) på en aktivitetsavhengig måte for å regulere stabilitet, lokalisering og funksjon6. En begrensning er at ABE-analysen krever affinitetsrensing med agaroseharpikser som konjugeres til avidin moieties som det siste trinnet i prosedyren, noe som resulterer i betydelig tap av signal som kompliserer kvantitativ analyse. Videre ka…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker K. Woolfrey for råd og innspill på APEGS-analysen. Disse studiene ble finansiert av forskningstilskudd til E.D. fra Whitehall Foundation og NIH-NIMH (1R01MH119347).
Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |