脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ
Summary
パルミトイル化は、16炭素パルミチン酸部分を、可逆的に標的タンパク質のシステイン残基に取り込む必要があります。ここでは、生化学的アプローチ、アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイについて、マウス脳ライセートに関心のある任意のタンパク質のパルミトイル化状態を調べる。
Abstract
シナプス後密度(PSD)内のシナプスAMPA受容体(AMPA)のレベルにおける活動依存的変化は、学習および記憶のための細胞メカニズムを表していると考えられている。パルミトイル化は、AMPA-Rs、補助因子、シナプス足場を含む多くのシナプスタンパク質の局在化と機能を活動依存的に調節します。我々は、AMPAに関連付け、シナプス強度を調節する脳特異的な膜貫通タンパク質をコードする4つの遺伝子(SynDIG1-4)のシナプス分化誘導遺伝子(SynDIG)ファミリーを同定した。SynDIG1は、活性依存性励起シナプスの発達に重要な並置膜貫通領域の位置191および192に位置する2つのシステイン残基でパルミトレート化される。ここでは、革新的な生化学的アプローチであるアシルPEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイについて、目的のタンパク質のパルミトリューション状態を調査し、マウス脳リセート中のSynDIGファミリーのタンパク質との有用性を実証する。
Introduction
S-パルミトリューションは、安定した膜会合、タンパク質の密売、およびタンパク質とタンパク質相互作用を調節する標的タンパク質の可逆的な翻訳後修飾である。パルミトイルアシルトランスセファーゼ(PAT)酵素によって触媒チオエステルリンケージを介してシステイン残基に16-炭素パルミチン酸部分を添加することを含む。脳内の多くのシナプスタンパク質は、安定性、局在化,、および機能,2、3、4を調節する活動依存的な方法で、AMPA-RsおよびPSD-95を含むパルミトレート化される。24PSD-95のようなシナプス足場との補助因子の相互作用によるPSD中のシナプスAMPプラスチックのレベルの変化は、シナプス可塑性を下にしている。したがって、シナプスタンパク質のパルミトイル化状態を決定する方法は、シナプス可塑性のメカニズムに関する重要な洞察を提供する。
以前は、AMPA5と関連する脳特異的な膜貫通タンパク質をコードする4つの遺伝子(SynDIG1-4)の5SynDIGファミリーを同定した。解約されたラット海馬ニューロンにおけるSynDIG1の過剰発現またはノックダウンは、それぞれ増加または減少し、AMPA-Rシナプスサイズおよび数は免疫細胞化学および電気生理学を用いて検出された〜50%ずつ増加または減少する。我々は、アシルビオチン交換(ABE)アッセイを利用して、SynDIG1が2つの保存された並膜貫通Cys残基(全SynDIGタンパク質に見られる)でパルミトレートされ、安定性、局在化、機能6を調節する活性依存的な方法で実証した。ABEアッセイは、改変とその後の親和性精製によって保護されたシステインに対するビオチンの交換に依存する7。ここでは、アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイ,88、9、10、11、1210,11という革新的な生化学的アプローチについて説明します。,912プロトコルは、適切な抗体が利用可能なマウス脳からの内因性膜タンパク質の調査のために記述されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
前の研究では、SynDIG1が2つの保存された並膜貫通Cys残基(すべてのSynDIGタンパク質に見られる)で、安定性、局在化、機能を調節する活性依存的な方法でパルミトレートされていることを実証するためにABEアッセイを利用しました。制限は、ABEアッセイは、手順の最終ステップとしてアビジン部分に結合したアガロース樹脂との親和性精製を必要とし、定量分析を複雑にするシ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、APEGSアッセイに関するアドバイスとインプットをK.ウールフリーに感謝する。これらの研究は、ホワイトホール財団とNIH-NIMH(1R01MH119347)からE.D.への研究助成金によって資金提供されました。
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
