في الموقع التهجين لسيبونكولوس nudus Coelomic السائل
Summary
يصف هذا البروتوكول نهج التهجين في الموقع الفعال للكشف عن مستويات التعبير mRNA والأنماط المكانية للجينات المستهدفة في السائل الكوليسي.
Abstract
التهجين في الموقع (ISH) هو تقنية مفيدة للغاية لتقديم أنماط التوزيع الخلوي لجينات محددة (على سبيل المثال، مرنا وncRNA) في الأنسجة. دودة sipunculid Sipunculus nudus هو مورد مصائد الأسماك الحاسمة كما أن لديها قيم غذائية وطبية عالية. حاليا ، فإن البحوث على البيولوجيا الجزيئية من Nudus Sipunculus لا تزال في مهدها. الغرض من هذه المقالة هو تطوير طريقة حساسة لتوطين مرنا محددة في السائل الكوليسي سيبونكولوس. يتضمن البروتوكول خطوات مفصلة من ISH ، بما في ذلك antisense المسمى digoxigenin وإعداد الريبوسبر بالإحساس ، وجمع السوائل الكيوموإعداد القسم ، وتهجين الريبوسوم المحدد ، واحتضان الأجسام المضادة ، والتلوين وعلاجات ما بعد التلوين. يتم عرض النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من تجربة ناجحة باستخدام هذه الطريقة. وينبغي أن ينطبق البروتوكول على أنواع سيفونكولا الأخرى أيضا.
Introduction
ISH، وذلك باستخدام مسبار الحمض النووي المسمى للكشف عن الحمض النووي محددة أو تسلسل الحمض النووي الريبي من الفائدة، هو وسيلة مفيدة لوصف نمط التعبير المكاني للجينات المستهدفة في الأنسجة المحفوظة شكليا1،2،3. عادة ، يتم إنشاء تسلسل الهدف عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ثم يستخدم كقالب لتوليف مسبار الحمض النووي الريبي المضاد / الإحساس المسمى بيوريدين-5-ثلاثي الفوسفات digoxigenin. يتم إصلاح العينات وpermeabilized قبل الحضانة مع الريبوسبر. بعد غسل قبالة التحقيق الزائد، يتم تصور التهجين من قبل الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة للأكسجين، وهو القلوية فوسفاتاز مترافق3،,4،,5،,6.
Sipunculus nudus (فيلوم سيبوناولا؛ النظام Sipunculida: Sipunculidae) هو دودة بحرية غير مجزأة، coelomate ومتناظرة ثنائيا7،8. Sipunculus nudus هو نوع عالمي موزعة على نطاق واسع في المياه الساحلية الاستوائية والمعتدلة. كما أنها مورد صيد بحري مهم في جنوب الصين بسبب قيمها الغذائية والطبية العالية9،10. ومع ذلك ، فإن Sipunculus nudus في البيولوجيا الجزيئية لا يزال في مراحله الأولى. لفهم الدور البيولوجي للجينات بشكل كامل ، فإن التحقيق في أنماط تعبير الجينات في قرار خلوي هو أمر مهم بشكل كبير. في الكائن غير النموذجي Sipunculus nudus، لم يتم بعد إنشاء طريقة ISH ، وهي طريقة مثالية للكشف عن أنماط تعبير الجينات. يحتوي السائل الكائي على عدة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الحبيبية ، وخلايا الجر ، والخلايا العمودية ، والخلايا الجرثومية ، والكريات الحمراء ، وما إلى ذلك11. الجنس المزدوج / ماب-3 عامل النسخ ذات الصلة-1(dmrt1),تستخدم كجين تمثيلي في هذه الطريقة, هو منظم النسخ المحفوظة للغاية من تحديد الجنس والتمايز في معظم الأنواع التي تتراوح بين اللافقاريات إلى الثدييات12,,13. في مجموعة من الأنواع (أي الإباحية السوداء، وما إلى ذلك) 14, تم التعبير عن dmrt1 في خلايا سيرتولي, المحيطة الخلايا الانباتية, وظيفتها مماثلة لخلايا التروبهوبلاس سبونكولوس. لذلك ، افترضنا أن dmrt1 من Sipunculus nudus يتم التعبير عنه في الخلايا الغذائية من الحيوانات المنوية ، ونتيجة لطريقة ISH أكدت بوضوح الفرضية.
يصف هذا البروتوكول لأول مرة ISH ، مع تحقيقات antisense/sense ssense /sense ssense ، لتحديد أنماط تعبير مرنا في مسحة السائل الكوافي. يتم توفير ظروف التفاعل الأمثل ، والتي تسمح بتصور حساس للغاية للتعبير مرنا بدقة عالية. يمكن تطبيق طريقة ISH المطورة في أنواع سيباونكوليدا أكثر من Sipunculus nudus.
Protocol
Representative Results
Discussion
أظهرت الدراسات السابقة أن ISH مناسبة للكشف عن RNAs متعددة الهدف16،17،18. في هذا البروتوكول، وصفنا طريقة ISH عالية الدقة للكشف عن مرنا في السائل coelomic والتأكيد على ظروف التهجين الأمثل في سيبونكولوس nudus. أظهرت الإشارات الواضحة لـ dmrt1 التي ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل صندوق العلماء الشباب التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31801034)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة فوجيان، الصين (2016J01161)، وصناديق البحث العلمي في جامعة هواتياو (15BS306) والصندوق المبتكر للدراسات العليا في البحث العلمي بجامعة هواتشياو.
Materials
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O’Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
