In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid
Summary
Denne protokol beskriver en effektiv in situ hybridisering tilgang til at opdage mRNA udtryk niveauer og rumlige mønstre af målgener i Sipunculus nudus coelomic væske.
Abstract
In situ hybridisering (ISH) er en meget informativ teknik til at præsentere cellulære distributionsmønstre for specifikke gener (f.eks mRNA og ncRNA) i væv. Den sipunculid ormen Sipunculus nudus er en afgørende fiskeressource, da det har høje ernæringsmæssige og medicinske værdier. I øjeblikket er forskningen i sipunculus nudus’ molekylærbiologi stadig i sin vorden. Formålet med denne artikel er at udvikle en følsom metode til lokalisering af specifikke mRNA i Sipunculus nudus coelomic væske. Protokollen indeholder detaljerede trin af ISH, herunder digoxigenin-mærket antisense og sans ekonnator præparat, coelomic væske indsamling og sektion forberedelse, specifikke riboprobe hybridisering, antistof inkubation, farve og post-farve behandlinger. De repræsentative resultater, der er opnået ved et vellykket forsøg ved hjælp af denne metode, er påvist. Protokollen bør også gælde for andre Sipuncula-arter.
Introduction
ISH, ved hjælp af en mærket nukleinsyre sonde til at opdage den specifikke DNA eller RNA sekvens af interesse, er en nyttig metode til at beskrive det rumlige udtryk mønster af målgener i morfologisk bevaret væv1,2,3. Normalt genereres målsekvensen af polymerasekædereaktion (PCR), og bruges derefter som skabelon til at syntetisere antisense/sense RNA-sonden mærket med digoxigenin uridin-5′-triphosphat. Prøverne fastsættes og gennemtrænges før inkubation med riboprobe. Efter vask af den overskydende sonde, hybridisering visualiseres ved immunhistokemi ved hjælp af en anti-digoxygenin antistof, som er alkalisk fosfatase-konjugeret3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; orden Sipunculida: Sipunculidae) er en usegmenteret, coelomate og bilateralt symmetrisk marine orm7,8. Sipunculus nudus er en kosmopolitisk art udbredt i tropiske og tempererede kystfarvande. Det er også en vigtig havfiskeressource i det sydlige Kina på grund af dets høje nærings- og lægemiddelværdier9,10. Men Sipunculus nudus i molekylærbiologi er stadig i sin vorden. For fuldt ud at forstå den biologiske rolle af gener, undersøgelse af gener udtryk mønstre på en cellulær opløsning er af stor interesse. I den ikke-model organisme Sipunculus nudus, ISH metode, som er en ideel metode til at opdage gener udtryk mønstre, er endnu ikke fastlagt. Dens coelomic væske indeholder flere celletyper, herunder granulocytter, urn celler, vesikulære celler, kimceller, erythrocytter, etc11. Den dobbelt køn/mab-3 relaterede transskriptionfaktor-1 (dmrt1), der anvendes som et repræsentativt gen i denne metode, er en meget bevaret transskriptionsregulator for kønsbestemmelse og differentiering hos de fleste arter lige fra hvirvelløse dyr til pattedyr12,13. I en række arter (dvs. sort porgy, osv.) 14, dmrt1 blev udtrykt i Sertoli celler, omkring germinale celler, hvis funktion svarer til trophoblast celler af Sipunculus nudus. Derfor har vi en hypotese, at dmrt1 af Sipunculus nudus udtrykkes i trophoblast celler af spermatozeugmata, og resultatet af ISH metode klart bekræftet hypotesen.
Denne protokol beskriver for første gang ISH, med digoxigenin-mærket antisense/sense mRNA-sonder, for at bestemme mRNA-ekspressionsmønstre i sin coelomic væskeudtværing. De optimale reaktionsbetingelser leveres, hvilket muliggør meget følsom visualisering af mRNA-udtryk ved høj opløsning. Den udviklede ISH metode kunne potentielt anvendes i flere Sipunculida arter end Sipunculus nudus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere undersøgelser viste , at ISH er egnet til påvisning af flere mål-RNA’er16,17,18. I denne protokol beskrev vi en ISH-metode med høj opløsning til at detektere mRNA i coelomisk væske og understrege de optimerede hybridiseringsforhold i Sipunculus-nudus. De åbenlyse signaler fra dmrt1, som vi observerede, viste en vellykket anvendelse af denne protokol til påvisning afgeneksp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), Natural Science Foundation of Fujian Province, Kina (2016J01161), Scientific Research Funds of Huaqiao University (15BS306) og Postgraduates’ Innovative Fund in Scientific Research of Huaqiao University.
Materials
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O’Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
