In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid
Summary
Denne protokollen beskriver en effektiv in situ hybridisering tilnærming for å oppdage mRNA uttrykksnivåer og romlige mønstre av målgener i Sipunculus nudus coelomic væske.
Abstract
In situ hybridisering (ISH) er en svært informativ teknikk for å presentere cellulære distribusjonsmønstre av spesifikke gener (f.eks. mRNA og ncRNA) i vev. Den sipunculid ormen Sipunculus nudus er en avgjørende fiskeriressurs som den har høye ernæringsmessige og medisinske verdier. For tiden er forskningen på molekylærbiologien til Sipunculus nudus fortsatt i sin barndom. Formålet med denne artikkelen er å utvikle en sensitiv metode for lokalisering av spesifikke mRNA i Sipunculus nudus coelomic væske. Protokollen inneholder detaljerte trinn av ISH, inkludert digoxigenin-merket antisense og følelse riboprobe forberedelse, coelomic væske samling og seksjon forberedelse, spesifikk riboprobe hybridisering, antistoff inkubasjon, fargestoffer og post-coloration behandlinger. De representative resultatene hentet fra et vellykket eksperiment ved hjelp av denne metoden er demonstrert. Protokollen skal også gjelde for andre Sipuncula-arter.
Introduction
ISH, ved hjelp av en merket nukleinsyresonde for å oppdage den spesifikke DNA- eller RNA-sekvensen av interesse, er en nyttig metode for å beskrive det romlige uttrykksmønsteret til målgener i morfologisk bevart vev1,,2,3. Normalt genereres målsekvensen av polymerasekjedereaksjon (PCR), og brukes deretter som mal for å syntetisere antisansen /sense RNA-sonden merket med digoksigeninuridine-5′-triphosfat. Prøvene er faste og permeabiliserte før inkubasjon med riboprobe. Etter å ha vasket av overflødig sonde, visualiseres hybridisering av immunohistokjemi ved hjelp av et anti-digoxygenin antistoff, som er alkalisk fosfatase-konjugert3,4,5,6.6
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; orden Sipunculida: Sipunculidae) er en unsegmented, coelomate og bilateralt symmetrisk marine orm7,8. Sipunculus nudus er en kosmopolitisk art utbredt i tropiske og tempererte kystnære farvann. Det er også en viktig marin fiskeriressurs i Sør-Kina på grunn av sine høye ernæringsmessige og medisinske verdier9,10. Sipunculus nudus i molekylærbiologi er imidlertid fortsatt i sin barndom. For å fullt ut forstå geners biologiske rolle, er undersøkelsen av generuttrykksmønstre med en cellulær oppløsning av stor interesse. I den ikke-modell organismen Sipunculus nuduser ISH-metoden, som er en ideell metode for å oppdage genenes uttrykksmønstre, ennå ikke etablert. Dens coelomic væske inneholder flere celletyper, inkludert granulocytter, urne celler, vesikulære celler, bakterieceller, erytrocytter, etc11. Den doble sex /mab-3 relaterttranskripsjon faktor-1 (dmrt1), brukt som et representativt gen i denne metoden, er en svært bevart transkripsjonsregulator av sex bestemmelse og differensiering i de fleste arter som spenner fra virvelløse dyr til pattedyr12,13. I en rekke arter (dvs. svart porgy, etc.) 14, dmrt1 ble uttrykt i Sertoli cellene, rundt germinal celler, hvis funksjon ligner trophoblast celler av Sipunculus nudus. Derfor hypotetiserte vi at dmrt1 av Sipunculus nudus uttrykkes i trophoblastceller av spermatozeugmata, og resultatet av ISH-metoden bekreftet tydelig hypotesen.
Denne protokollen beskriver for første gang ISH, med digoxigenin-merkede antisense / sense mRNA-sonder, for å bestemme mRNA-uttrykksmønstre i sitt koelomisk væskesmøring. De optimale reaksjonsforholdene leveres, noe som tillater svært sensitiv visualisering av mRNA-uttrykk ved høy oppløsning. Den utviklede ISH-metoden kan potensielt brukes i flere sipunculida arter enn Sipunculus nudus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere studier viste at ISH er egnet for å oppdage flere mål RNAs16,17,18. I denne protokollen beskrev vi en høyoppløsnings ISH-metode for å oppdage mRNA i koelomisk væske og understreke de optimaliserte hybridiseringsforholdene i Sipunculus nudus. De åpenbare signalene fra dmrt1 vi observerte demonstrerte vellykket anvendelse av denne protokollen ved påvisning av genuttrykk (fig…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), Natural Science Foundation of Fujian Province, Kina (2016J01161), Scientific Research Funds of Huaqiao University (15BS306) og Postgraduates’ Innovative Fund in Scientific Research of Huaqiao University.
Materials
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Noxious substance |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Noxious substance |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosive |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Noxious substance |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
References
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).
- Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes. Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
- Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos. Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).
- Abler, L. L., et al. A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract. Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).
- Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences. Biochemical Genetics. 47, 884 (2009).
- Lemer, S., et al. Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics. Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).
- Jiang, S., et al. Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice. Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).
- Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract. Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).
- Ying, X. P., et al. The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta. Micron. 41, 71-78 (2010).
- Raymond, C. S., Murphy, M. W., O’Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation. Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).
- Kopp, A. Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism. Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).
- Wu, G. C., et al. Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy. Biology of Reproduction. 86, 41 (2012).
- Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1. Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361 (1993).
