Her presenteres standardiserte protokoller for å vurdere induksjon av varmesjokkresponsen (HSR) i caenorhabditis elegans ved hjelp av RT-qPCR på molekylært nivå, fluorescerende reportere på cellenivå og thermorecovery på organismenivå.
Varmesjokkresponsen (HSR) er en cellulær stressrespons indusert av cytosolisk protein som fungerer for å gjenopprette proteinfolding homeostase eller proteostase. Caenorhabditis elegans opptar en unik og kraftig nisje for HSR forskning fordi HSR kan vurderes på molekylære, cellulære, og organismenivåer. Derfor kan endringer på molekylært nivå visualiseres på cellenivå, og deres virkninger på fysiologi kan kvantiseres på organismenivå. Mens analyser for måling av HSR er enkle, gjør variasjoner i timing, temperatur og metodikk som er beskrevet i litteraturen det utfordrende å sammenligne resultater på tvers av studier. Videre fungerer disse problemene som en barriere for alle som ønsker å innlemme HSR-analyse i sin forskning. Her presenteres en rekke protokoller for måling av induksjon av HSR på en robust og reproduserbar måte med RT-qPCR, fluorescerende journalister og en organismetetemercovery analyse. I tillegg viser vi at en mye brukt termotoleransanalyse ikke er avhengig av den veletablerte masterregulatoren til HSR, HSF-1, og bør derfor ikke brukes til HSR-forskning. Til slutt, variasjoner i disse analysene funnet i litteraturen er diskutert og beste praksis er foreslått for å bidra til å standardisere resultater over hele feltet, til slutt legge til rette nevrodegenerativ sykdom, aldring, og HSR forskning.
Varmesjokkresponsen (HSR) er en universell cellulær stressrespons forårsaket av cytosolisk proteinfeilfolding forårsaket av temperaturøkninger og andre protetotoksiske påkjenninger. Aktivering av HSR i Caenorhabditis elegans fører til transkripsjonell upregulering av varmesjokkgener som hsp-70 og hsp-16.2. Mange varmesjokkproteiner (HSPs) fungerer som molekylære chaperoner som gjenoppretter proteinfolding homeostase, eller proteostase, ved å samhandle direkte med feilfoldede eller skadede proteiner. Hovedregulatoren til HSR er transkripsjonsfaktoren Heat Shock Factor 1 (HSF-1), hvis aktivering er elegant kontrollert via flere mekanismer1.
Rollen til HSF-1 er ikke begrenset til stress. HSF-1 er nødvendig for normal vekst og utvikling, som sletting av hsf-1 fører til larval arrest2. HSF-1 er også viktig under aldring og aldersrelaterte nevrodegenerative sykdommer preget av akkumulering av proteinaggregater og manglende evne til å opprettholde proteostase. Knockdown av hsf-1 forårsaker akkumulering av proteinaggregater og en forkortet levetid, mens overuttrykk av hsf-1 reduserer proteinaggregasjon og forlengerlevetiden 3,4. Regulering av HSF-1 på molekylært nivå har derfor brede implikasjoner for organismefysiologi og sykdom.
C. elegans er en kraftig modell organisme for HSR forskning fordi HSR kan måles på molekylære, cellulære, og organismenivåer4,5,6. Fremhever kraften i denne modellen, viktige fremskritt i å avgrense HSR-banen, for eksempel vevsspesifikke forskjeller i HSR-regulering, har blitt oppdaget i C. elegans7,8. Videre er C. elegans mye brukt til aldring forskning og er et voksende system for modellering sykdommer knyttet til proteostase avbrudd.
Selv om varmesjokkeksperimenter med C. elegans kan være raske og reproduserbare, er det flere spørsmål å vurdere før du begynner. For eksempel hvilken temperatur bør brukes til induksjon av HSR og hvor lenge skal ormene bli utsatt? Er det bedre å bruke en tørr inkubator eller et vannbad? Hvilket utviklingsstadium bør brukes? Dessverre varierer metodene som brukes til å undersøke HSR mye fra laboratorium til laboratorium, noe som forårsaker forvirring når du velger de beste metodene og gjør det vanskelig å sammenligne resultater på tvers av feltet.
Vi presenterer robuste og standardiserte protokoller for bruk av RT-qPCR, fluorescerende reportere og thermorecovery for å måle HSR. Mens disse tre tilnærmingene er komplementære, har de hver unike fordeler og ulemper. For eksempel er RT-qPCR den mest direkte og kvantitative målingen av HSR, og denne analysen kan enkelt utvides til å omfatte mange forskjellige varmesjokkfremkallende gener. RT-qPCR er imidlertid den dyreste, kan teknisk sett være vanskelig, og krever bruk av spesialisert utstyr. I motsetning har fluorescerende journalister fordelen av å måle vevsspesifikke forskjeller i HSR-induksjon. De er imidlertid vanskelige å kvantumate nøyaktig, kan bare måle induksjon over en viss terskel, og krever bruk av et fluorescensmikroskop. I tillegg er reporterstammene som er beskrevet her, utviklingsmessig forsinket i forhold til standard N2-belastning. Selv om nyere reporter stammer som inneholder single-copy transgenes er tilgjengelige, har de ikke blitt testet her9. Den tredje analysen, thermorecovery, har fordelen av å gi en fysiologisk relevant avlesning på organismenivå. Denne analysen er imidlertid uten tvil den minst følsomme og mest indirekte. Til slutt diskuterer vi noen vanlige variasjoner som finnes i disse analysene og foreslår et sett med beste praksis for å lette forskningen på dette feltet.
I litteraturen har et bredt spekter av temperaturer, tider og utstyr blitt brukt til å analysere HSR, som har innført unødvendige advarsler og ført til vanskeligheter med å sammenligne resultater mellom laboratorier. For eksempel har temperaturer fra 32-37 °C og ganger fra 15 min til flere timer blitt brukt til å indusere HSR15. Det er imidlertid rapportert at dødelighet oppstår så tidlig som 3 timer ved 37 °C for alle stadier og 1,5 timer for dag 1 voksne15. Videre viser vi at eksponering av ormer til 35 °C forårsaker dødelighet som ikke er HSF-1 avhengig, noe som gjør disse forholdene dårlig egnet for analyse av HSR. I motsetning er et varmesjokk på 33 °C i 1 timer robust nok til å fremkalle sterk induksjon av varmesjokkgener, men mild nok til ikke å påvirke orm levedyktighet. Faktisk, eksponering for 33 ° C så lenge 6 h bare fører 20% av ormer til å vise unormal bevegelse. Derfor foreslår vi å bruke en temperatur på 33 °C og en tid på 1 timer som standardisert tilstand for RT-qPCR og fluorescerende reporteranalyser.
Nylige eksperimenter har vist at utviklingsoppsamling av ormer for HSR-eksperimenter er spesielt viktig. Det ble nylig vist at i C. elegans inducibility av HSR avtar (dvs. kollapser) med > 50% når hermafroditter begynner egg legging5. Iscenesettelse av ormene riktig er kritisk fordi det ofte er forskjeller i utviklingstidspunktet i stammer som bærer mutasjoner. Hvis temperaturfølsomme mutanter brukes, vil dette også påvirke resultatene hvis de ikke synkroniseres etter deres reproduktive alder. Derfor anbefales det å nøye måle utbruddet av egglegging for hver belastning for å bestemme når kollapsen oppstår. Tidsvinduet etter L4-smeltet og før initiering av reproduktiv modenhet er smal; Derfor må det utvises forsiktighet slik at HSR-kollapsen ikke utilsiktet forårsaker variasjon i resultatene.
I tillegg til utviklingstid kan overraskende små temperaturendringer, så lite som 1 °C, ha betydelige effekter på HSR. For eksempel er termosensoriske nevroner i C. elegans følsomme for temperaturendringer så små som ± 0,05 °C16. Dermed er det viktig å bruke et termometer som nøyaktig kan måle temperaturen. Derfor foreslår vi som beste praksis bruk av en kalibrert enhet for temperaturmåling som er nøyaktig nok til å måle temperaturer innen ± 0,1 °C. Videre bør et termometer med dataloggingsfunksjonalitet brukes til å måle temperaturvariasjoner over tid. Mange inkubatorer er spesifisert å ha termiske variasjoner på mer enn 1 °C i ulike deler av inkubatoren og over tid, noe som kan ha betydelige effekter på HSR-eksperimenter. Som en beste praksis foreslår vi å bruke inkubatorer som har tilstrekkelig isolasjon og sirkulasjon for å minimere temperatursvingninger. For å gjennomføre varmesjokkeksperimenter foreslår vi en beste praksis med et sirkulerende vannbad. Tiden det tar for en agar plate å nå en ønsket temperatur er ca 6-7 min i et vannbad, men mye lenger i en tørr inkubator15,17. Men hvis et sirkulerende vannbad ikke er tilgjengelig, har vi vist at robust HSR induksjon også forekommer i en tørr inkubator ved hjelp av våre forhold. Hvis en tørr inkubator brukes, bør åpning av inkubatoren for varigheten av stresset minimeres.
Det er veletablert at induksjon av varmesjokkgener er avhengig av hovedregulatoren til HSR, HSF-1. Her presenterer vi bevis for at de to indirekte analysene, fluorescerende journalister og thermorecovery, også er avhengige av HSF-1. Betydelig fant vi at en vanlig alternativ organismeanalyse, termotolerans, ikke er HSF-1 avhengig ved hjelp av hsf-1 RNAi (Figur 4). Lignende resultater har tidligere blitt rapportert ved hjelp av en hsf-1 mutant eller en ttx-3 mutant, som blokkerer HSR18,19,20. Sammen indikerer disse resultatene at termotolerance analysen ikke skal brukes til HSR-forskning. Videre tyder dette på at en beste praksis er å teste HSF-1 avhengighet for enhver analyse som brukes til å måle HSR.
Samlet presenterer vi en rekke standardiserte protokoller og beste praksis for robust og reproduserbar måling av HSR-induksjon i C. elegans. Vi håper at disse metodene vil redusere variasjonen i HSR-eksperimenter og øke reproduserbarheten. Å legge til rette for direkte sammenligninger av HSR-forskning mellom laboratorier vil bidra til å akselerere forskningen på HSR-feltet. Videre vil standardisering være til nytte for forskning på aldring og nevrodegenerative sykdommer som HSR er nært forbundet med.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en donasjon fra Frank Leslie. Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
||
AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
||
C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
||
hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |