कैंसर सेल संस्कृतियों से एकत्र मध्यम में तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किए गए चुनिंदा किनुरेन्स का एक साथ मात्राकरण
Summary
यहां वर्णित कैंसर सेल संस्कृतियों से एकत्र माध्यम में काइनुरेनिन मार्ग (काइनुरेनिन, 3-हाइड्रोक्सीक्यूरेनिन, एक्सनथ्यूरिनिक एसिड, 3-हाइड्रोक्सिथ्रिलिक एसिड) में उत्पन्न चार अलग-अलग ट्रिप्टोफान मेटाबोलाइट्स के निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल है जो एक क्वाड्रपोल स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया जाता है।
Abstract
किनुरेनिन पाथवे और किनुरेनिन्स नामक ट्राइप्टोफान कैटाबोलाइट्स को प्रतिरक्षा विनियमन और कैंसर जीव विज्ञान में उनकी भागीदारी के लिए बढ़ा हुआ ध्यान मिला है। एक इन विट्रो सेल संस्कृति परख का उपयोग अक्सर रोग तंत्र में विभिन्न ट्रिप्टोफान कैटाबोलाइट्स के योगदान के बारे में जानने और चिकित्सीय रणनीतियों के परीक्षण के लिए किया जाता है। कोशिका संस्कृति माध्यम जो स्रावित मेटाबोलाइट्स और सिग्नलिंग अणुओं से समृद्ध है, ट्रिप्टोफान मेटाबोलिज्म और अन्य सेलुलर घटनाओं की स्थिति को दर्शाता है। जटिल सेल संस्कृति माध्यम में कई kynurenines के विश्वसनीय मात्राकरण के लिए नए प्रोटोकॉल कई नमूनों के एक विश्वसनीय और त्वरित विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए वांछित हैं । इसे तरल क्रोमेटोग्राफी के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ पूरा किया जा सकता है। इस शक्तिशाली तकनीक मेटाबोलाइट्स के मात्राकरण के लिए कई नैदानिक और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में कार्यरत है और kynurenines को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग चार किनुरेनिन्स के एक साथ निर्धारण के लिए एकल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एसक्यू) के साथ मिलकर किया गया है, यानी किनुरेनिन, 3-हाइड्रोक्सीकिनुरेनिन, 3-हाइड्रोक्सीनथ्रिनिलिक, और विट्रो कल्चरल कैंसर कोशिकाओं से एकत्र किए गए माध्यम में xanthurenic एसिड । एसक्यू डिटेक्टर का उपयोग करने के लिए सरल है और अन्य बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर की तुलना में कम महंगा है। एसक्यू-एमएस विश्लेषण में, नमूने से कई आयनों को उनके विशिष्ट मास-टू-चार्ज अनुपात(एम/जेड)के अनुसार उत्पन्न और अलग किया जाता है, जिसके बाद एकल आयन मॉनिटरिंग (सिम) मोड का उपयोग करके पता लगाया जाता है।
यह पेपर रिपोर्ट की गई विधि के फायदों पर ध्यान खींचता है और कुछ कमजोर बिंदुओं को इंगित करता है। यह क्रोमेटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ नमूना तैयारी सहित एलसी-एसक्यू विश्लेषण के महत्वपूर्ण तत्वों पर केंद्रित है। गुणवत्ता नियंत्रण, विधि अंशांकन स्थितियों और मैट्रिक्स प्रभाव के मुद्दों पर भी चर्चा की जाती है। हमने 3-नाइट्रोटिरोसिन के एक साधारण आवेदन को सभी लक्ष्य विश्लेषण के लिए एक एनालॉग मानक बताया। जैसा कि मानव अंडाशय और स्तन कैंसर कोशिकाओं के साथ प्रयोगों द्वारा पुष्टि की गई है, प्रस्तावित एलसी-एसक्यू विधि विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करती है और आगे अन्य इन विट्रो सेलुलर मॉडलों पर लागू की जा सकती है।
Introduction
किनुरेनिन पाथवे (केपी) मानव कोशिकाओं में ट्राइप्टोफान (टीआरपी) कैटाबोलिज्म का प्रमुख मार्ग है। इंडोलमाइन-2,3-डायोक्सीजेनेज (इडो-1) एक्सपेरिमेंटिक कोशिकाओं में केपी का पहला और सीमन एंजाइम है और टीआरपी को एन-फॉर्मिलक्नुरेनिन1में परिवर्तित करता है। केपी के भीतर आगे के कदम अन्य माध्यमिक मेटाबोलाइट्स उत्पन्न करते हैं, अर्थात् किनुरेनिन जो विभिन्न जैविक गुणों को प्रदर्शित करते हैं। Kynurenine (Kyn) पहली स्थिर टीआरपी कैटाबोलाइट विषाक्त गुणों को दिखाने और aryl हाइड्रोकार्बन रिसेप्टर (AhR)2के लिए बाध्यकारी के बाद सेलुलर घटनाओं को विनियमित है । इसके बाद, Kyn को अनायास या एंजाइम-मध्यस्थता प्रक्रियाओं में कई अणुओं में बदल दिया जाता है, जो 3-हाइड्रोक्सीक्यून्यूरेनिन (3HKyn), एंथ्रोलिक एसिड (एए), 3-हाइड्रोक्सेन्थ्रिलिक एसिड (3-HAA), kynurenic एसिड (Kyna), और xanthurenic एसिड (XA) जैसे मेटाबोलाइट्स पैदा करते हैं । एक और डाउनस्ट्रीम मेटाबोलाइट, 2-अमीनो-3-कार्बोक्सीमुकोनिक एसिड-6-सेमीलडिहाइड (एसीएम), क्विनोलिक एसिड (क्यूए) या पिकालिक एसिड (पीए)1के लिए गैर-एंजाइमेटिक साइक्लिंग से गुजरता है । अंत में क्यूए को आगे निकोटिनामाइड-एडेनाइन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडी+)3,केपी एंड-पॉइंट मेटाबोलाइट में तब्दील कर दिया जाता है जो एक महत्वपूर्ण एंजाइम कोफैक्टर है । कुछ किनुरेन्स में न्यूरोप्रोटेक्टिव गुण जैसे कि कायना और पीए होते हैं, जबकि अन्य, यानी, 3HAA और 3HKyn, विषाक्त4हैं। Xanthurenic एसिड, जो 3HKyn से बनता है, एंटीऑक्सीडेंट और वासोरलेक्सेशन गुण5प्रस्तुत करता है । XA एजिंग लेंस में जमा होता है और एपिथेलियल कोशिकाओं के एपोप्टोसिस की ओर जाता है6. 20वीं शताब्दी के मध्य में वर्णित केपी ने विभिन्न विकारों में अपनी भागीदारी का प्रदर्शन करने पर अधिक ध्यान दिया। इस मेटाबोलिक मार्ग की बढ़ी हुई गतिविधि और कुछ किनुरेनिन्स का संचय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करता है और अवसाद, सिजोफ्रेनिया, एंसेफेलोपैथी, एचआईवी, डिमेंशिया, एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस, मलेरिया, अल्जाइमर, हंटिंगटन रोग और कैंसर4,7जैसी विभिन्न रोगों की स्थितियों से जुड़ा हुआ है। टीआरपी मेटाबॉलिज्म में कुछ परिवर्तन ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंटमेंट्स और कैंसर कोशिकाओं में देखे जाते हैं2,8. इसके अलावा, kynurenines आशाजनक रोग मार्कर 9 के रूप में मानाजाताहै । कैंसर अनुसंधान में, इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल अच्छी तरह से स्थापित किए जाते हैं और व्यापक रूप से कैंसर रोधी दवाओं के लिए प्रतिक्रियाओं के पूर्व-नैदानिक मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाते हैं10। टीआरपी मेटाबोलाइट्स को कोशिकाओं द्वारा संस्कृति माध्यम में स्रावित किया जाता है और उन्हें किनुरेनिन मार्ग की स्थिति का आकलन करने के लिए मापा जा सकता है। इसलिए, एक आसान, लचीला और विश्वसनीय प्रोटोकॉल के साथ विभिन्न जैविक नमूनों में यथासंभव अधिक से अधिक केपी मेटाबोलाइट्स का एक साथ पता लगाने के लिए उपयुक्त तरीके विकसित करने की आवश्यकता है।
इस पेपर में, हम कैंसर कोशिकाओं से एकत्र किए गए संस्कृति के बाद के माध्यम में एलसी-एसक्यू द्वारा चार किनुरेनिन पाथवे मेटाबोलाइट्स के एक साथ दृढ़ संकल्प के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं: Kyn, 3HKyn, 3HAA, और XA। आधुनिक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण में, तरल क्रोमेटोग्राफी13,14,15,16 को जैव रासायनिक गैर-विशिष्ट परिशोधन के विपरीत, ईहरलिच रिएजेंट11,12 का उपयोग करने के विपरीत व्यक्तिगत ट्रिप्टोफान कैटाबोलाइट्स का एक साथ पता लगाने और मात्राकरण के लिए पसंद कियाजाताहै। वर्तमान में, मानव नमूनों में किनुरेन्स निर्धारण के लिए कई विधियां उपलब्ध हैं, मुख्य रूप से पराबैंगनी या फ्लोरेसेंस डिटेक्टरों13,17, 18,19के साथ तरल क्रोमेटोग्राफी पर आधारित हैं। तरल क्रोमेटोग्राफी एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डिटेक्टर (एलसी-एमएस) के साथ मिलकर इस प्रकार के विश्लेषण के लिए अधिक उपयुक्त लगता है, उनकी उच्च संवेदनशीलता (पता लगाने की निचली सीमा), चयनशीलता और पुनरावृत्ति के कारण।
टीआरपीमेटाबोलाइट्स पहले से ही मानव सीरम, प्लाज्मा और मूत्र13, 20, 21,22,23में निर्धारित किया गया है, हालांकि, सेल संस्कृति माध्यम कीतरहअन्य जैविक नमूनों के लिए तरीके भी वांछित हैं। इससे पहले, मानव ग्लियोमा कोशिकाओं, मोनोसाइट्स, डेंड्रिटिक कोशिकाओं या एस्ट्रोसाइट्स के इलाज के बाद एकत्र किए गए माध्यम में टीआरपी-व्युत्पन्न यौगिकों के लिए एलसी-एमएस का उपयोग इंटरफेरॉन गामा (आईएफएन-γ)24, 25, 26के साथ कियाजाताथा। वर्तमान में, नए मान्य प्रोटोकॉल की आवश्यकता है जो कैंसर मॉडल में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न संस्कृति मीडिया, कोशिकाओं और उपचारों में कई मेटाबोलाइट्स के आकलन की अनुमति दे सकते हैं।
विकसित विधि का उद्देश्य (एक विश्लेषणात्मक रन के भीतर) चार प्रमुख किनुरेनिन्स को निर्धारित करना है जो केपी में असामान्यताओं को इंगित कर सकते हैं। यहां प्रस्तुत एक आंतरिक मानक (3-नाइट्रोटिरोरोसिन, 3NT) का उपयोग कर चयनित सार्थक kynurenines के मात्रात्मक एलसी-एसक्यू विश्लेषण के लिए हमारे हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम हैं, जो इन विट्रो सुसंस्कृत मानव कैंसर कोशिकाओं से एकत्र किए गए माध्यम में27हैं। हमारे सर्वोत्तम ज्ञान के लिए, यह इन विट्रो उगाई कोशिकाओं से प्राप्त संस्कृति माध्यम में 3HKyn, 3HAA, Kyn और XA के एक साथ मात्राकरण के लिए पहला एलसी-एसक्यू प्रोटोकॉल है। कुछ संशोधनों पर, विधि को सेल संस्कृति मॉडल की एक व्यापक श्रृंखला में टीआरपी चयापचय में परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए आगे लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर चार प्रमुख टीआरपी मेटाबोलाइट्स (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) के एक साथ मात्राकरण के लिए एक विस्तृत एलसी-एसक्यू प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसे इन विट्रो सुसंस्कृत मानव कैंसर कोशिकाओं से एक माध्यम में मापा जात…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को यूरोपीय संघ द्वारा पूर्वी पोलैंड के परिचालन कार्यक्रम विकास के तहत यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष से समर्थन दिया गया था 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), जैव प्रौद्योगिकी के संकाय और पर्यावरण विज्ञान के संकाय द्वारा जॉन पॉल द्वितीय कैथोलिक विश्वविद्यालय लुब्लिन (युवा वैज्ञानिकों अनुदान इलोना सवोक के लिए), पोलिश नेशनल साइंस सेंटर, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 मगदलीना Staniszewska, सिद्धांत अन्वेषक के लिए) । लेखकों ने सेल क्रीडिंग और प्रोटीन क्वांटिफिकेशन के लिए उपकरण साझा करने के लिए ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस, सेंटर फॉर इंटरडिसिप्लिनरी रिसर्च, जेपीआईआई CUL की प्रयोगशाला से प्रो एग्निस्का स्काइबियर का शुक्रिया अदा किया ।
Materials
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
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