Gelijktijdige kwantificering van geselecteerde kynurenines geanalyseerd door vloeibare chromatografie-massaspectrometrie in medium verzameld uit kankercelculturen
Summary
Hier beschreven is een protocol voor de bepaling van vier verschillende tryptofaanmetabolieten gegenereerd in de kynurenine route (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic zuur, 3-hydroxyanthranilic zuur) in het medium verzameld uit kankercelculturen geanalyseerd door vloeibare chromatografie in combinatie met een enkele viervoudige massaspectrometrie.
Abstract
De kynurenine route en de tryptofaan katabolieten genaamd kynurenines hebben meer aandacht gekregen voor hun betrokkenheid bij immuunregulatie en kankerbiologie. Een in vitro celkweektest wordt vaak gebruikt om te leren over de bijdrage van verschillende tryptofaankabolieten in een ziektemechanisme en voor het testen van therapeutische strategieën. Celkweekmedium dat rijk is aan uitgescheiden metabolieten en signaalmoleculen weerspiegelt de status van het tryptofaanmetabolisme en andere cellulaire gebeurtenissen. Nieuwe protocollen voor de betrouwbare kwantificering van meerdere kynurenines in het complexe celkweekmedium zijn gewenst om een betrouwbare en snelle analyse van meerdere monsters mogelijk te maken. Dit kan worden bereikt met vloeibare chromatografie in combinatie met massaspectrometrie. Deze krachtige techniek wordt in veel klinische en onderzoekslaboratoria gebruikt voor de kwantificering van metabolieten en kan worden gebruikt voor het meten van kynurenines.
Hier wordt het gebruik van vloeibare chromatografie in combinatie met enkele viervoudige massaspectrometrie (LC-SQ) gepresenteerd voor de gelijktijdige bepaling van vier kynurenines, d.w.z. kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic en xanthurenic acid in het medium dat wordt verzameld uit in vitro gekweekte kankercellen. SQ-detector is eenvoudig te gebruiken en goedkoper in vergelijking met andere massaspectrometers. In de SQ-MS-analyse worden meerdere ionen uit het monster gegenereerd en gescheiden op basis van hun specifieke massa-tot-ladingsverhouding(m/z),gevolgd door de detectie met behulp van een Sim-modus (Single Ion Monitoring).
Dit document vestigt de aandacht op de voordelen van de gerapporteerde methode en geeft enkele zwakke punten aan. Het is gericht op kritieke elementen van LC-SQ-analyse, waaronder monstervoorbereiding, samen met chromatografie en massaspectrometrieanalyse. Ook de kwaliteitscontrole, methodekalibratieomstandigheden en matrixeffectproblemen komen aan bod. We beschreven een eenvoudige toepassing van 3-nitrotyrosine als één analoge standaard voor alle doelanalyten. Zoals bevestigd door experimenten met menselijke eierstok- en borstkankercellen, genereert de voorgestelde LC-SQ-methode betrouwbare resultaten en kan deze verder worden toegepast op andere in vitro cellulaire modellen.
Introduction
Kynurenine pathway (KP) is de belangrijkste route van tryptofaan (Trp) katabolisme in menselijke cellen. Indoolamine-2,3-dioxygenase (IDO-1) in extrahepatische cellen is het eerste en beperkende enzym van KP en zet Trp om in N-formylkynurenine1. Verdere stappen binnen KP genereren andere secundaire metabolieten, namelijk kynurenines die verschillende biologische eigenschappen vertonen. Kynurenine (Kyn) is de eerste stabiele Trp-katabole die toxische eigenschappen vertoont en cellulaire gebeurtenissen reguleert na binding aan de arylkoolwaterstofreceptor (AhR)2. Vervolgens wordt Kyn omgezet in verschillende moleculen, hetzij spontaan, hetzij in de enzymgemedieerde processen, waardoor dergelijke metabolieten zoals 3-hydroxykynurenine (3HKyn), anthranilic acid (AA), 3-hydroxyanthranilic acid (3-HAA), kynurenic acid (Kyna) en xanthurenic acid (XA) worden gegenereerd. Een andere downstream metaboliet, 2-amino-3-carboxymuconzuur-6-semialdehyde (ACMS), ondergaat niet-enzymatische cyclisatie naar chinolienzuur (QA) of picolininezuur (PA)1. Ten slotte wordt QA verder omgezet in nicotinamide-adenine dinucleotide (NAD+)3, de KP-eindpuntmetaboliet die een belangrijke enzymcofactor is. Sommige kynurenines hebben neuroprotectieve eigenschappen zoals Kyna en PA, terwijl de andere, d.w.z. 3HAA en 3HKyn, giftig zijn4. Xanthurenic zuur, dat wordt gevormd uit 3HKyn, presenteert antioxiderende en vasorelaxatie eigenschappen5. XA hoopt zich op in verouderende lenzen en leidt tot apoptose van epitheelcellen6. KP, beschreven in het midden van de 20e eeuw, kreeg meer aandacht toen zijn betrokkenheid bij verschillende aandoeningen werd aangetoond. Verhoogde activiteit van deze metabolische route en accumulatie van sommige kynurenines moduleren de immuunrespons en worden geassocieerd met verschillende pathologische aandoeningen zoals depressie, schizofrenie, encefalopathie, HIV, dementie, amyotrofische laterale sclerose, malaria, Alzheimer, de Ziekte van Huntington en kanker4,7. Sommige veranderingen in het Trp-metabolisme worden waargenomen in tumormicromilieus en kankercellen2,8. Bovendien worden kynurenines beschouwd als veelbelovende ziektemarkers9. In kankeronderzoek worden in vitro celkweekmodellen goed ingeburgerd en veel gebruikt voor preklinische evaluatie van reacties op geneesmiddelen tegen kanker10. Trp-metabolieten worden door cellen uitgescheiden in het kweekmedium en kunnen worden gemeten om de status van de kynurenineroute te beoordelen. Daarom is het nodig om geschikte methoden te ontwikkelen voor de gelijktijdige detectie van zoveel mogelijk KP-metabolieten in een verscheidenheid aan biologische specimens met een eenvoudig, flexibel en betrouwbaar protocol.
In dit artikel beschrijven we een protocol voor de gelijktijdige bepaling van vier kynurenine pathway metabolieten: Kyn, 3HKyn, 3HAA en XA door LC-SQ in een post-culture medium verzameld uit kankercellen. In een moderne analytische benadering heeft vloeibare chromatografie13,14,15,16 de voorkeur voor de gelijktijdige detectie en kwantificering van de individuele tryptofaankabolieten, in tegenstelling tot biochemische niet-specifieke tests met behulp van Ehrlich-reagens11,12. Op dit moment zijn er veel methoden beschikbaar voor kynurenines bepaling in menselijke specimens, voornamelijk gebaseerd op vloeibare chromatografie met ultraviolette of fluorescentiedetectoren13,17,18,19. Vloeibare chromatografie in combinatie met een massaspectrometriedetector (LC-MS) lijkt meer geschikt voor dit type analyse, vanwege hun hogere gevoeligheid (lagere detectiegrenzen), selectiviteit en herhaalbaarheid.
Trp-metabolieten zijn al bepaald in menselijk serum, plasma en urine13,20,21,22,23, maar de methoden voor andere biologische specimens, zoals celkweekmedium, zijn ook gewenst. Voorheen werd LC-MS gebruikt voor Trp-afgeleide verbindingen in een medium dat werd verzameld na cultivering van menselijke glioomcellen, monocyten, dendritische cellen of astrocyten behandeld met interferon gamma (IFN-γ)24,25,26. Momenteel is er behoefte aan nieuwe gevalideerde protocollen die een beoordeling van verschillende metabolieten in verschillende kweekmedia, cellen en behandelingen die in kankermodellen worden gebruikt, mogelijk kunnen maken.
Het doel van de ontwikkelde methode is om (binnen één analytische run) vier belangrijke kynurenines te kwantificeren die kunnen wijzen op afwijkingen in KP. Hier worden kritieke stappen gepresenteerd van ons onlangs gepubliceerde protocol voor kwantitatieve LC-SQ-analyse van geselecteerde betekenisvolle kynurenines met behulp van één interne standaard (3-nitrotyrosine, 3NT) in het medium verzameld uit in vitro gekweekte menselijke kankercellen27. Voor zover wij weten, is het het eerste LC-SQ-protocol voor gelijktijdige kwantificering van 3HKyn, 3HAA, Kyn en XA in een kweekmedium verkregen uit de in vitro gekweekte cellen. Bij sommige wijzigingen kan de methode verder worden toegepast om de veranderingen in het Trp-metabolisme in een breder scala aan celkweekmodellen te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel presenteert een gedetailleerd LC-SQ-protocol voor de gelijktijdige kwantificering van vier belangrijke Trp-metabolieten (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) die worden gemeten in een medium uit in vitro gekweekte menselijke kankercellen. Speciale aandacht wordt besteed aan het monsterpreparaat, de chromatografische/massaspectrometrieprocedure en de gegevensinterpretatie, de belangrijkste punten binnen de analyse.
Over het algemeen vereist LC-MS-analyse, vanwege hoge gevoeligheid, de hoo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Europese Unie van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling in het kader van het Operationeel Programma Ontwikkeling oost-Polen 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), door de Faculteit Biotechnologie en Milieuwetenschappen van de John Paul II Catholic University of Lublin (Young Scientists grant for Ilona Sadok), Polish National Science Centre, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 voor Magdalena Staniszewska, Principle Investigator). De auteurs danken Prof. Agnieszka Ścibior van het Laboratory of Oxidative Stress, Centre for Interdisciplinary Research, JPII CUL voor het delen van de apparatuur voor celcultiuring en eiwitkwantificering.
Materials
| 3-hydroksy-DL-kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-hydroxyanthranilic acid | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-nitro-L-tyrosine | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitrile | Supelco | 1.00029 | hypergrade for LC-MS LiChrosolv |
| Activated charcoal | Supelco | 05105 | powder |
| Analytical balance | Ohaus | ||
| Analytical column | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm) |
| Ammonium formate | Supelco | 7022 | eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Caps for chromatographic vials | Agilent Technologies | 5185-5820 | blue screw caps,PTFE/red sil sepa |
| Cell culture dish | Nest | 704004 | polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Cell culture plate | Biologix | 07-6012 | 12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille |
| Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5415R | |
| Centrifuge | Eppendorf | model 5428 | |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-2278 | Eppendorf type, 1.5 mL |
| Centrifuge tubes | Bionovo | B-3693 | Falcon type, 50 mL, PP |
| Chromatographic data acqusition and analysis software | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographic insert vials | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µL |
| Chromatographic vials | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, clear glass |
| Dimethyl sulfoxide | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual meter pH/conductivity | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Evaporator | Genevac | model EZ-2.3 Elite | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formic acid | Supelco | 5.33002 | for LC-MS LiChropur |
| Glass bottle for reagents storage | Bionovo | S-2070 | 50 mL, clear glass |
| Guard column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm) |
| Hydrochloric acid | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-kynurenine | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥98% (HPLC) |
| Magnetic stirrer | Wigo | ES 21 H | |
| Microbalance | Mettler Toledo | model XP6 | |
| Milli-Q system | Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV with Pump |
| Quadrupole mass spectrometer | Agilent Technologies | G1948B | model 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plate reader | Bio Tek | Synergy 2 operated by Gen5 | |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad | 500-0006 | |
| See-saw rocker | Stuart | SSL4 | |
| Serological pipette | Nest | 326001 | 5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Merck | 1.06346.1000 | |
| Solvent inlet filter | Agilent Technologies | 5041-2168 | glass filter, 20 μm pore size |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, clear glass |
| Solvent reservoir (for LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, amber glass |
| Spreadsheet program | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Stir bar | Bionovo | 6-2003 | teflon coated |
| Syringe filters for culture medium filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm |
| Syringe filters for mobile phase components filtration | Bionovo | 6-0018 | nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm |
| Tissue culture plates | VWR | 10062-900 | 96-wells, sterille |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-High Performance Liquid Chromatography system | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C) |
| Ultrasound bath | Polsonic | 104533 | model 6D |
| Vortex | Biosan | model V-1 plus | |
| Xanthurenic acid | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
References
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
- Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
- Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neurosciences. 367, 85-97 (2017).
- Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
- Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
- Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286 (2018).
- Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Recherche en cancérologie. 14 (40), 2377-2384 (2015).
- Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
- Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
- Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
- Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
- Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
- Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
- Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
- Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
- Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
- Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).
- Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
- Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
- Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
- Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
- Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
- Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
- Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
- Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
- Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
- Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , (2019).
- Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416 (2009).
- Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).
