Immunolocalisation fluorescente des protéines arabinogalactan et des pectines dans la paroi cellulaire des tissus végétaux

Summary

Ce protocole décrit en détail comment le matériel végétal pour l’immunolocalisation des protéines arabinogalactan et des pectines est fixé, incorporé dans une résine acrylique hydrophilique, sectionné et monté sur des glissières en verre. Nous montrons que des épitopes liés à la paroi cellulaire seront détectés avec des anticorps spécifiques.

Abstract

Le développement des plantes implique des ajustements constants de la composition et de la structure de la paroi cellulaire en réponse à des stimuli internes et externes. Les parois cellulaires sont composées de cellulose et de polysaccharides non cellulosiques ainsi que de protéines, de composés phénoliques et d’eau. 90 % de la paroi cellulaire est composée de polysaccharides (p. ex., pectines) et de protéines arabinogalactan (APC). L’immunolocalisation fluorescente d’épitopes glycan spécifiques dans les sections histologiques végétales demeure un outil clé pour découvrir le remodelage des réseaux, de la structure et des composants de polysaccharide de mur.

Ici, nous rapportons une procédure optimisée d’immunolocalisation fluorescente pour détecter les épitopes glycan des ARG et des pectines dans les tissus végétaux. La fixation de paraformaldéhyde/glutaraldehyde a été employée avec l’intégration LR-White des échantillons de plante, permettant une meilleure conservation de la structure et de la composition de tissu. Des sections minces des échantillons incorporés obtenus avec un ultra-microtome ont été utilisées pour l’immunolocalisation avec des anticorps spécifiques. Cette technique offre une grande résolution, une grande spécificité et la possibilité de détecter plusieurs épitopes glycan dans le même échantillon. Cette technique permet la localisation subcellulaire des glycanes et détecte leur niveau d’accumulation dans la paroi cellulaire. Il permet également la détermination des modèles spatio-temporels de la distribution d’AGP et de pectine pendant des processus développementaux. L’utilisation de cet outil peut en fin de compte guider les orientations de recherche et relier les glycanes à des fonctions spécifiques chez les plantes. En outre, les informations obtenues peuvent compléter les études biochimiques et d’expression génique.

Introduction

Les parois cellulaires végétales sont des structures complexes composées de polysaccharides et de glycoprotéines. Les parois cellulaires sont des structures extrêmement dynamiques dont l’architecture, l’organisation et la composition varient selon le type de cellule, la localisation, le stade de développement, les stimuli externes^{et internes 1}. Les protéines arabinogalactan (AGPs) et les pectines sont des composants importants de la paroi cellulaire végétale. Les APC sont des protéines fortement glycoylées et les pectines sont des polysaccharides homogalacturonan dont la composition, la quantité et la structure varient considérablement au cours....

Protocol

1. Préparation de l’échantillon : fixation, déshydratation et intégration LR-Blanc

1. Fixation et déshydratation
   REMARQUE : Le processus de fixation est essentiel pour préserver l’échantillon; en croisant les molécules, le métabolisme cellulaire est arrêté, assurant l’intégrité cellulaire et empêchant la diffusion moléculaire. Les agents fixatifs et la concentration utilisée doivent être ajustés à cette fin, laissant les antigènes suffisamment exposés pour interagir avec les anticorps. Le protocole suivant combine la capacité fixative douce du paraformaldéhyde, avec l’effet plus fort du glutaraldehyde. Leurs proportions ont été optimisées po....

Results

Dans une expérience réussie, l’anticorps secondaire identifiera spécifiquement l’emplacement de l’épitope spécifique en vert vif, d’une manière cohérente, permettant la caractérisation de la composition de la paroi cellulaire à un certain stade de développement de la cellule, du tissu ou de l’organe. Par exemple, l’anticorps LM6 a une forte affinité pour 1,5-arabinan, un composé avec type I rhamnogalacturonan qui peut être trouvé abondamment l’étiquetage de la paroi cellulaire de l’anthère quercus suber en dével.......

Discussion

La méthode d’immunolocalisation fluorescente chez les plantes décrite ici, bien que parfaitement simple, repose sur le succès de plusieurs petits pas. Le premier est la préparation et la fixation de l’échantillon. Au cours de cette première étape, un mélange de formaldéhyde et de glutaraldehyde est utilisé pour croiser la majorité des composants cellulaires. Le formaldéhyde dans la solution fournit une fixation douce et réversible tandis que le glutaraldehyde fournit un lien plus fort et plus permanent ; l’équilibre entr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 % (p/v) de glutéraldéhyde	Agar Scientific	AGR1010	aq. Solution, sans méthanol
8 puits Lames de réaction en verre	Marinfeld	MARI1216750	d’autres marques peuvent être utilisées
Acide acétique	Sigma-Aldrich	A6283
Anticorps anti-IgG (molécule de wole)-FITC produit dans	Sigma-Aldrich	F6258
, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	La lamelle doit couvrir tous les puits. D’autres marques peuvent être utilisées  ;
ddH2O	na	na
Éthanol absolu	na na
Azurant 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Gélules de gélatine	Agar scientific	AGG29211	La taille de la gélule doit correspondre à la taille de l’échantillon.
Flacons en verre	na na	na N’importe	quels flacons en verre simples et peu coûteux qui peuvent être scellés, peuvent être utilisés. Les flacons peuvent être nettoyés avec de l’éthanol à 96 % après utilisation pour éliminer les résidus de LR-White et réutilisés.
Le grade LR-white est de qualité moyenne, contenant de la résine Agar	Scientific	AGR1281	LR-White se présente sous plusieurs formes ; le grade moyen fournit un support de coupe adéquat pour la plupart des tissus, tandis que pour les tissus plus durs, un grade plus dur de LR-white peut être recommandé. Si possible, utilisez une résine déjà mélangée avec l’activateur de polimération (peroxyde de benzoyle), sinon, veuillez suivre les instructions du fournisseur pour préparer la résine.
Lait écrémé en poudre	Nestlé ;	na	tout lait écrémé en poudre est adéquat
Four	na na		four de laboratoire générique
Boîte de Pétri, 10 cm x 10 cm carré	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Sondes monoclonales anti-plante générées par le rat		na	Plusieurs anticorps qui reconnaissent les composants de la paroi cellulaire sont disponibles à la fois au Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) et Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, à l’Université de Leeds, au Royaume-Uni). Une courte liste de certains MABS couramment utilisés et où ils peuvent être achetés est présentée dans le tableau supplémentaire 1
Lames de rasoir	na	na	lames de rasoir régulières
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
Toluidine Blue-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC7
Microscope à épifluorescence vertical avec filtres de fluorescence UV et FITC	Leica Mycrosistems	DMLb
Chambre à vide	na na	na
Pompe à vide	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	D’autres anti-décoloration peuvent être utilisés. Veuillez vérifier la compatibilité avec FITC et l’azurant 28. (Remarque : pour une solution de rechange non commerciale, (voir Jonhson et coll., 198218) Un milieu anti-décoloration peut être fabriqué en mélangeant 25 mg/mL de 1,4-diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) dans du glycérol 9:1 (v/v) à du 1xPBS. Ajustez le pH à 8,6 avec du HCl dilué.)