Usando citometria de fluxo para detectar e quantificar a formação sanguínea alterada no zebrafish em desenvolvimento
Summary
Este ensaio é um método simples para quantificar células hematopoiéticas no desenvolvimento de zebrafish embrionário. As células sanguíneas de zebrafish dissociados são submetidas à análise de citometria de fluxo. Isso permite a detecção de defeitos sanguíneos em animais mutantes e após modificação genética.
Abstract
A diversidade de linhagens celulares que compõem sangue maduro em animais vertebrados decorre da diferenciação de células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Este é um processo crítico que ocorre ao longo da vida útil dos organismos, e a interrupção das vias moleculares envolvidas durante a embriogênese pode ter consequências catastróficas a longo prazo. Por uma infinidade de razões, o zebrafish (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo para estudar hematopoiese. Os embriões de zebrafish desenvolvem-se externamente, e em 7 dias a pós-fertilização (dpf) produziram a maioria dos subtipos de células sanguíneas definitivas que persistirão por toda a vida. Foram desenvolvidos ensaios para avaliar o número de células hematopoiéticas, utilizando principalmente manchas histológicas específicas, técnicas de hibridização in situ e microscopia de animais transgênicos que utilizam promotores específicos de células sanguíneas que conduzem a expressão de proteínas fluorescentes. No entanto, a maioria dos ensaios de coloração e técnicas de hibridização in situ não quantificam com precisão o número de células sanguíneas presentes; apenas grandes diferenças nos números de células são facilmente visualizadas. A utilização de animais transgênicos e a análise de indivíduos com microscopia fluorescente ou confocal podem ser realizadas, mas a quantitação desses ensaios depende da contagem manual ou do uso de softwares de imagem caros, ambos podem cometer erros. O desenvolvimento de métodos adicionais para avaliar o número de células sanguíneas seria econômico, mais rápido, e poderia até mesmo ser automatizado para avaliar rapidamente o efeito da modificação genética mediada pelo CRISPR, a redução da transcrição mediada por morfolino e o efeito de compostos medicamentosos que afetam a hematopoiese em larga escala. Este novo ensaio para quantificar as células sanguíneas é realizado pela dissociação de embriões inteiros de zebrafish e pela análise da quantidade de células sanguíneas fluorescentes rotuladas presentes. Esses ensaios devem permitir a elucidação de vias moleculares responsáveis pela geração, expansão e regulação das células sanguíneas durante a embriogênese, o que permitirá aos pesquisadores descobrir ainda mais novos fatores alterados durante doenças sanguíneas, bem como caminhos essenciais durante a evolução da hematopeiese vertebrada.
Introduction
A produção de sangue (hematopoiese) é um processo de desenvolvimento essencial que começa primeiro no embrião inicial. Esse processo começa gerando glóbulos vermelhos primitivos e macrófagos diretamente do mesoderme, e posteriormente muda para a produção de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Essas células-tronco, que são multipotentes, geram todas as variedades de células sanguíneas maduras no organismo. Capaz de auto-renovação, o sistema é continuamente reabastecido através desses HSPCs. Enquanto esse processo começa no início do desenvolvimento, a hematopoiese continua para a vida do animal, fornecendo a capacidade de transportar oxigênio para locais distantes do corpo, parar de sangrar após lesões e proteger o corpo de infecções. O desenvolvimento deste complexo sistema é controlado temporal e espacialmente durante o desenvolvimento e qualquer perturbação na produção de células sanguíneas pode ser catastrófica para o organismo, resultando em anemia, trombocitopenia, leucopenia e leucemia.
Um modelo animal popular usado para pesquisa hematopoiética é o zebrafish (Danio rerio) porque eles têm desenvolvimento sanguíneo semelhante quando comparados aos humanos. Na verdade, muitos dos genes e vias moleculares usados durante a hematopoiese são conservados ao longo da evolução dos vertebrados, permitindo-nos aprender sobre genes humanos estudando zebrafish. É importante ressaltar que os embriões de zebrafish se desenvolvem fora do corpo e em 7 dias geraram a maioria dos tipos de células sanguíneas maduras, permitindo a visualização direta do sistema hematopoiético em um curto espaço de tempo. Os zebrafish também são extremamente fecundos, o que permite aos pesquisadores observar um número maior de amostras em um curto espaço de tempo, o que também é importante para a geração de dados reprodutíveis. O tempo de curta geração e o desenvolvimento externo do zebrafish proporcionam uma manipulação e observação mais fáceis durante os estudos de mutagênese1,2,3,4,5 e triagem de medicamentos6,7,8,9,10. Isso permite que um painel de compostos terapêuticos promissores para distúrbios sanguíneos humanos seja testado de forma rápida e eficiente.
É importante ressaltar que os zebrafish também são geneticamente favoráveis, e o genoma é sequenciado e anotado. Essa tratobilidade permite que técnicas de genética reversa, como o knockdown mediado por morpholino e ablação genética mediada pelo CRISPR sejam realizadas. Os zebrafish também provaram sua utilidade como modelo para realizar telas genéticas avançadas; muitos genes e caminhos essenciais envolvidos na formação de sangue de vertebrados foram descobertos desta maneira. Numerosos métodos de observação de células sanguíneas também foram desenvolvidos em zebrafish. Embora existam técnicas tradicionais de coloração histológica, também é possível realizar hibridização in situ para transcrições específicas do sangue. É importante ressaltar que existem numerosas linhas transgênicas de peixes pelas quais as proteínas fluorescentes são expressas por promotores específicos da linhagem, permitindo a rotulagem de células sanguíneas específicas com proteínas fluorescentes11. Isso permite que os pesquisadores realizem observação a ponto da gênese das células sanguíneas, expansão e regulação em um organismo vivo ao longo do tempo.
No geral, a conservação do sistema hematopoiético, a presença e o fácil desenvolvimento de linhas transgênicas, fácil visualização e tempo de geração curta tornaram o zebrafish um modelo econômico, rápido e adaptável de hematopoiese. Para melhorar a caixa de ferramentas de técnicas disponíveis para pesquisadores de zebrafish, desenvolvemos este ensaio para quantificar robustamente o número de células sanguíneas em embriões. O método envolve a digestão de animais transgênicos e a realização de citometria de fluxo para células sanguíneas fluorescentes. Desta forma, as células sanguíneas de animais mutantes, o efeito da modificação mo e crispr, e o efeito de pequenas moléculas podem ser analisados quantitativamente de forma rápida e reprodutível. Esses ensaios são formas fáceis de usar e econômicas para enumerar as células sanguíneas, permitindo o exame de sua geração, proliferação e manutenção ao longo do tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish é um excelente sistema modelo para estudar hematopoiese vertebral primitiva e definitiva. Ao longo das últimas décadas, vários ensaios foram desenvolvidos e refinados, permitindo que o zebrafish se tornasse um modelo rápido e econômico para testar drogas, gerar e testar mutantes genéticos, e, em geral, permitir que os pesquisadores analisassem caminhos moleculares essenciais para a hematopoiese. Este protocolo utiliza zebrafish embrionários que permite a coleta rápida de dados, o uso de menos espaço f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH: R15 DK114732-01 para d.L.S.), pela National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 a D.L.S.), e pelo Programa de Honra da Universidade Estadual da Califórnia Chico (para K.F.R.). Os autores agradecem a Betsey Tamietti pela gestão laboratorial e Kathy Johns pela assistência administrativa.
Materials
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
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