Utilizzo della citometria a flusso per rilevare e quantificare la formazione di sangue alterato nel pesce zebra in via di sviluppo
Summary
Questo saggio è un metodo semplice per quantificare le cellule ematopoietiche nello sviluppo di zebrafish embrionali. Le cellule del sangue di zebrafish dissociate sono sottoposte ad analisi citometriche a flusso. Ciò consente di rilevare difetti del sangue negli animali mutanti e dopo la modificazione genetica.
Abstract
La diversità dei lignaggi cellulari che comprendono sangue maturo negli animali vertebrati deriva dalla differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC). Questo è un processo critico che si verifica per tutta la durata della vita degli organismi, e l’interruzione delle vie molecolari coinvolte durante l’embriogenesi può avere conseguenze catastrofiche a lungo termine. Per una moltitudine di motivi, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un organismo modello per studiare l’ematopoiesi. Gli embrioni di zebrafish si sviluppano esternamente e entro 7 giorni la postfertilizzazione (dpf) ha prodotto la maggior parte dei sottotipi di cellule del sangue definitive che persisteranno per tutta la vita. Sono stati sviluppati saggi per valutare il numero di cellule ematopoietiche, utilizzando principalmente specifiche macchie istologiche, tecniche di ibridazione in situ e microscopia di animali transgenici che utilizzano promotori specifici delle cellule del sangue che guidano l’espressione di proteine fluorescenti. Tuttavia, la maggior parte dei saggi di colorazione e delle tecniche di ibridazione in situ non quantificano accuratamente il numero di cellule del sangue presenti; solo grandi differenze nei numeri di cella sono facilmente visualizzabili. È possibile eseguire l’utilizzo di animali transgenici e l’analisi di individui con microscopia fluorescente o confocale, ma la quantificazione di questi test si basa sul conteggio manuale o sull’utilizzo di costosi software di imaging, entrambi in grado di commetti errori. Lo sviluppo di metodi aggiuntivi per valutare il numero di cellule del sangue sarebbe economico, più veloce e potrebbe anche essere automatizzato per valutare rapidamente l’effetto della modificazione genetica mediata dalla CRISPR, la riduzione della trascrizione mediata dal morfolino e l’effetto dei composti farmacologici che influenzano l’ematopoiesi su larga scala. Questo nuovo saggio per quantificare le cellule del sangue viene eseguito dissociando interi embrioni di zebrafish e analizzando la quantità di cellule del sangue etichettate fluorescentmente presenti. Questi test dovrebbero consentire la spiegazione delle vie molecolari responsabili della generazione, dell’espansione e della regolazione delle cellule del sangue durante l’embriogenesi, che consentirà ai ricercatori di scoprire ulteriormente nuovi fattori alterati durante le malattie del sangue, nonché percorsi essenziali durante l’evoluzione dell’ematopoiesi dei vertebrati.
Introduction
La produzione di sangue (ematopoiesi) è un processo di sviluppo essenziale che inizia per la prima volta nell’embrione precoce. Questo processo inizia generando globuli rossi primitivi e macrofagi direttamente dal mesoderma, e successivamente si sposta verso la produzione di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC). Queste cellule staminali, che sono multipotenti, generano tutte le varietà di cellule del sangue mature nell’organismo. In grado di auto-rinnovarsi, il sistema viene continuamente rifornito attraverso questi HSPC. Mentre questo processo inizia all’inizio dello sviluppo, l’ematopoiesi continua per la vita dell’animale, fornendo la capacità di trasportare ossigeno in siti lontani del corpo, di fermare il sanguinamento dopo la lesione e di proteggere il corpo dall’infezione. Lo sviluppo di questo complesso sistema è controllato temporaneamente e spazialmente durante lo sviluppo e qualsiasi perturbazione nella produzione di cellule del sangue può essere catastrofica per l’organismo, con conseguente anemia, trombocitopenia, leucopenia e leucemia.
Un modello animale popolare utilizzato per la ricerca ematopoietica è il pesce zebra (Danio rerio) perché hanno uno sviluppo del sangue simile rispetto all’uomo. Infatti, molti dei geni e delle vie molecolari utilizzate durante l’ematopoiesi sono conservati in tutta l’evoluzione dei vertebrati, permettendoci di conoscere i geni umani studiando il pesce zebra. È importante sottolineare che gli embrioni di zebrafish si sviluppano al di fuori del corpo ed entro 7 giorni hanno generato la maggior parte dei tipi di cellule del sangue mature, consentendo la visualizzazione diretta del sistema ematopoietico in breve tempo. Gli zebrafish sono anche estremamente fecondi, il che consente ai ricercatori di osservare un numero maggiore di campioni in un breve lasso di tempo, che è anche importante per generare dati riproducibili. Il tempo di breve generazione e lo sviluppo esterno del pesce zebra facilitano la manipolazione e l’osservazione durante gli studi di mutagenesi1,2,3,4,5 e lo screeningfarmacologico 6,7,8,9,10. Ciò consente di testare in modo rapido ed efficiente un pannello di composti terapeutici promettenti per i disturbi del sangue umano.
È importante sottolineare che anche i pesci zebra sono geneticamente suscettibili e il genoma viene sequenziato e annotato. Questa trattabilità consente di eseguire tecniche di genetica inversa come la knockdown mediata da morfolino- (MO-) e l’ablazione genetica mediata da CRISPR. Zebrafish ha anche dimostrato la sua utilità come modello per eseguire schermi genetici in avanti; molti geni e percorsi essenziali coinvolti nella formazione del sangue dei vertebrati sono stati scoperti in questo modo. Numerosi metodi di osservazione delle cellule del sangue sono stati sviluppati anche nel pesce zebra. Mentre esistono tecniche di colorazione istologica tradizionali, è anche possibile eseguire l’ibridazione in situ per trascrizioni specifiche del sangue. È importante sottolineare che esistono anche numerose linee transgeniche di pesci in cui le proteine fluorescenti sono espresse da promotori specifici del lignaggio, consentendo l’etichettatura di cellule del sangue specifiche con proteinefluorescenti 11. Ciò consente ai ricercatori di eseguire un’osservazione fino al minuto della genesi, dell’espansione e della regolazione delle cellule del sangue in un organismo vivente nel tempo.
Nel complesso, la conservazione del sistema ematopoietico, la presenza e il facile sviluppo di linee transgeniche, la facile visualizzazione e il tempo di breve generazione hanno reso il pesce zebra un modello economico, veloce e adattabile di ematopoiesi. Per migliorare la cassetta degli attrezzi delle tecniche disponibili per i ricercatori di zebrafish, abbiamo sviluppato questo saggio per quantificare saldamente il numero di cellule del sangue negli embrioni. Il metodo prevede la digestione di animali transgenici e l’esecuzione della citometria a flusso per le cellule del sangue fluorescenti. In questo modo, le cellule del sangue di animali mutanti, l’effetto della modifica MO e CRISPR e l’effetto di piccole molecole possono essere analizzati quantitativamente in modo rapido e riproducibile. Questi test sono modi intuitivi ed economici per enumerare le cellule del sangue, consentendo l’esame della loro generazione, proliferazione e manutenzione nel tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli zebrafish sono un eccellente sistema modello per lo studio dell’ematopoiesi vertebrata primitiva e definitiva. Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati e perfezionati diversi test, consentendo al pesce zebra di diventare un modello rapido ed economico per testare farmaci, generare e testare mutanti genetici e, nel complesso, consentire ai ricercatori di analizzare percorsi molecolari essenziali per l’ematopoiesi. Questo protocollo utilizza zebrafish embrionali che consente una rapida raccolta dei dati, l’uso di me…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I finanziamenti sono stati forniti dal National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 a D.L.S.), dalla National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 to D.L.S.), e dal Honor’s Program della California State University Chico (a K.F.R.). Gli autori ringraziano Betsey Tamietti per la gestione del laboratorio e Kathy Johns per l’assistenza amministrativa.
Materials
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
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