Misurazione della risposta dei farmaci in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico
Summary
Introduciamo un protocollo per misurare la risposta del farmaco in tempo reale nelle fette di tessuto tumorale organotipico. La strategia sperimentale qui descritta fornisce una piattaforma per effettuare schermi di farmaci a medio-alta produzione su fette di tessuto derivate da tumori clinici o murini in condizioni di ex vivo.
Abstract
I tessuti tumorali sono composti da cellule cancerose, cellule immunitarie infiltrate, cellule endoteliali, fibroblasti e matrice extracellulare. Questo complesso ambiente costituisce il microambiente tumorale (TME) e può modulare la risposta alla terapia in vivo o alla risposta ai farmaci ex vivo. Gli schermi convenzionali di scoperta dei farmaci oncologici vengono effettuati su cellule coltivate in un monostrato, un sistema che manca criticamente l’influenza della TME. Pertanto, i sistemi sperimentali che integrano saggi sensibili e ad alto consumo con TME fisiologico rafforzeranno il processo preclinico di scoperta dei farmaci. Qui, introduciamo la coltura della fetta del tessuto tumorale ex vivo come piattaforma per lo screening farmacologico medio-alto.di velocità. La coltura delle fette di tessuto organitipotico costituisce sezioni tumorali sottili e tagliate con precisione che vengono mantenute con il supporto di una membrana porosa in un’interfaccia ad aria liquida. In questo protocollo, descriviamo la preparazione e la manutenzione di fette di tessuto preparate da tumori di topo e tumori da modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente. Per valutare i cambiamenti nella vitalità dei tessuti in risposta al trattamento farmacologico, abbiamo sfruttato un test di vitalità biocompatibile basato sulla luminescenza che consente la misurazione in tempo reale, rapida e sensibile delle cellule vitali nel tessuto. Utilizzando questa piattaforma, abbiamo valutato le risposte dipendenti dalla dose di fette di tessuto all’inibitore multi-chinasi, alla staurosporina e all’agente citotossico, doxorubicina. Inoltre, dimostriamo l’applicazione di fette di tessuto per la farmacologia ex vivo esaminando 17 farmaci clinici e preclinici su fette di tessuto preparati da un singolo tumore PDX. La nostra piattaforma di screening ex vivo fisiologicamente rilevante, altamente sensibile e robusta rafforzerà notevolmente la scoperta di farmaci oncologici preclinici e il processo decisionale per il trattamento.
Introduction
Le interazioni delle cellule tumorali con le proprietà fisiche e biochimiche del tessuto stromale circostante formano il TME. TME può stimolare la crescita del tumore, metastasi, e modulare la risposta del tumore alla terapia1. Nello sviluppo di farmaci preclinici convenzionali, i farmaci farmaci sono in genere sottoposti a screening utilizzando linee cellulari oncologiche coltivate, una piattaforma di analisi che manca criticamente del TME2. Questa mancanza di TME fisiologico nelle fasi di prescreening basate sulle cellule può limitare la scoperta di agenti efficaci nei modelli animali portatori di tumore e può contribuire all’alto tasso di logoramento di molti farmaci oncologici promettenti nelle fasi cliniche successive dello sviluppo3.
Nonostante l’importanza del TME nella modulazione delle risposte ai farmaci tumorali, i vincoli sperimentali limitano l’applicazione di sistemi più fisiologicamente rilevanti durante le prime fasi della scoperta e dello sviluppo dei farmaci. È impraticabile vagliare centinaia di agenti terapeutici su tumori da modelli animali o campioni di tumore del paziente. In effetti, gli esemplari chirurgici sono scarse risorse con diversi background genetici e lo screening di migliaia di molecole candidate nei modelli animali non è fattibile a causa della scala sperimentale, dei costi e del benessere degli animali.
La coltura della falamuna del tessuto tumorale, dove le sezioni tumorali sottili e tagliate con precisione sono coltivate ex vivo, può affrontare la limitazione del TME fisiologico nei saggi di screening farmacologico. Storicamente, il campo delle neuroscienze ha aperto la strada e ha fatto ampie ottimizzazioni della coltura delle fette per il tessuto cerebrale4. Recentemente, molti studi hanno dimostrato la preparazione di fette da vari tipi di tessuto tumorale, tra cui tumori derivati dalla linea cellulare, modelli di tumore spontanei, xenografti derivati dal paziente (PDX) e tumori primari del paziente. La coltura della faldatrice di tessuto ex vivo integra i benefici della cultura in vivo e in vitro5. Le fette di tessuto tumorale mantengono l’architettura del tessuto intatta e la composizione cellulare variegata, consentendo lo studio delle cellule tumorali all’interno del contesto TME.
Questo protocollo introduce un sistema di coltura della coltura delle fette di tessuto tumorale organotico combinato con un saggio di fattibilità in tempo reale e altamente sensibile per valutare le risposte ai farmaci. I test di efficacia farmacologica sulle fette di tessuto tumorale organotipiche in protocolli precedentemente introdotti si basano sulla misurazione dei cambiamenti nella vitalità cellulare mediante incorporazione di coloranti fluorescenti, immunoistochimica (IHC) o MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 difenile tetrazoli) come detto96,7,8. Tuttavia, tutti questi metodi sono saggi di punto finale e soffrono di bassa sensibilità, lunghi tempi di elaborazione, analisi dei dati complessi, portata del segnale ristretta e alto errore sperimentale. Il nostro reagente compatibile con le cellule vive basato sulla luminescenza migliora questi saggi fornendo un’ampia gamma di segnali e una misurazione istantanea (5 minuti) senza elaborazione preliminare e post-elaborazione minima. Questo reagente è altamente sensibile e può coesistere nei mezzi di coltura cellulare, consentendo la misurazione continua e del percorso temporale della vitalità cellulare. Questo sistema di analisi è applicabile allo screening ad alto consumo dei farmaci candidati sulle fette di tessuto nello sviluppo di farmaci preclinici.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, dimostriamo una piattaforma per studi quantitativi e di efficacia dei farmaci in tempo reale sulle fette di tessuto tumorale organotipipico. Il sistema di coltura delle fette di tessuto offre vantaggi distinti rispetto ai tradizionali metodi in vitro basati sulle cellule catturando l’eterogeneità cellulare e le caratteristiche fisiologiche del microambiente tumorale nativo. Questa piattaforma consente inoltre una maggiore produttività per i test di efficacia dei farmaci, contribuendo a colmare il …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] e dalla Fondazione Sidney Kimmel [Kimmel Scholar Award], lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Ringraziamo la dott.ssa Alana Welm (Università dello Utah) per aver fornito il tumore al PDX del cancro al seno. Vorremmo anche ringraziare il personale di Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) per la manutenzione del modello PDX e dei membri del laboratorio Gujral per discussioni utili. N.N.A è supportato dalla JSPS Overseas Research Fellowship e dal Interdisciplinary Training Grant della FHCRC. A.J.B. è supportato dal Chmoosome Metabolism and Cancer Training Grant della FHCRC.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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