मैक्रोमॉलिक्यूलर क्राउडिंग का उपयोग करके मानव क्यूटिनियस हाइपरट्रोफिक स्कैरिंग के विट्रो मॉडल में
Summary
यह प्रोटोकॉल एक इन विट्रो ह्यूमन हाइपरट्रोफिक निशान ऊतक मॉडल बनाने के लिए मैक्रोमॉलिक्यूलर क्राउडिंग के उपयोग का वर्णन करता है जो वीवो स्थितियों में जैसा दिखता है। जब भीड़ भाड़ वाले मैक्रोमॉलिक्यूलर वातावरण में खेती की जाती है, तो मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट फेनोटाइप, बायोकेमिस्ट्री, फिजियोलॉजी और निशान ऊतक जैसी कार्यात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
यह दिखाया गया है कि वीवो ऊतकों में प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन, पॉलीसैकराइडआदि आदि की अत्यधिक भीड़ होती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल विट्रो में सेल संस्कृतियों के लिए तटस्थ बहुलक (क्राउडर्स) के अलावा के माध्यम से इस शारीरिक भीड़ की नकल करने के लिए एक मैक्रोमॉलिक्यूलर क्राउजिंग (एमएमसी) तकनीक लागू करता है। क्राउडर्स के रूप में फिकॉल या डीएक्सटीन का उपयोग करने वाले पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि WI38 और WS-1 सेल लाइनों में कोलेजन I और फाइब्रोनेक्टिन की अभिव्यक्ति को एमएमसी तकनीक का उपयोग करके काफी बढ़ाया जाता है। हालांकि, इस तकनीक को प्राथमिक हाइपरट्रोफिक निशान-व्युत्पन्न मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट (एचएचएसएफ) में मान्य नहीं किया गया है। चूंकि हाइपरट्रोफिक निशान कोलेजन के अत्यधिक जमाव से उत्पन्न होता है, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एचएचएसएफ के साथ एमएमसी तकनीक लागू करके विट्रो हाइपरट्रोफिक निशान मॉडल में कोलेजन से भरपूर का निर्माण करना है। इस अनुकूलित एमएमसी मॉडल को पारंपरिक 2-आयामी (2-डी) सेल संस्कृति प्रणालियों की तुलना में वीवो निशान ऊतक में अधिक समानताएं रखने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, यह पशु मॉडल की तुलना में लागत प्रभावी, समय कुशल और नैतिकता की दृष्टि से वांछनीय है। इसलिए, यहां रिपोर्ट किए गए अनुकूलित मॉडल हाइपरट्रोफिक निशान से संबंधित अध्ययनों के लिए एक उन्नत “वीवो-लाइक” मॉडल प्रदान करता है।
Introduction
निशान ऊतक ऊतक की मरम्मत के अंतिम बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, कई व्यक्तियों में, विशेष रूप से जलने या आघात1से पीड़ित लोग, जख्म अत्यधिक हो सकते हैं और चंगा त्वचा की आकृति विज्ञान और कामकाज पर अवांछनीय प्रभाव डाल सकते हैं। यद्यपि रोग (हाइपरट्रोफिक निशान और केलोइड) निशान गठन के सटीक तंत्र को पूरी तरह से समझ में नहीं आता है, घाव भरने के दौरान कोलेजन के अत्यधिक जमाव को एक आवश्यक योगदान2होने का प्रदर्शन किया गया है।
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि विकास कारक बीटा 1 (टीजीएफ-1) और अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (αSMA) को बदलने से हाइपरट्रोफिक निशान के गठन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सबूत से पता चलता है कि ऊंचा TGF-1 सीधे SMAD सिग्नलिंग पाथवे3को विनियमित करने के माध्यम से कोलेजन के अत्यधिक जमाव को उत्तेजित करता है । इसके अलावा, αSMA घाव चिकित्सा प्रक्रिया4में सेल संकुचन और reepithelialization को विनियमित करके हाइपरट्रोफिक निशान गठन में योगदान करने के लिए पाया गया है । विट्रो में उपयुक्त की कमी और वीवो मॉडल में निशान उपचारण के लिए हस्तक्षेप और उपचार ों के विकास और मूल्यांकन की दिशा में एक बड़ी बाधा है। इस अध्ययन का उद्देश्य मौजूदा एमएमसी तकनीक का उपयोग “वीवो-जैसे” हाइपरट्रोफिक निशान मॉडल का निर्माण करने के लिए करना है जो उपन्यास और उभरते निशान से संबंधित हस्तक्षेपों के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है।
शरीर के बाहर रहने वाले ऊतकों को पुन: उत्पन्न करना वैज्ञानिक समुदाय में वर्षों से एक लक्ष्य रहा है। बीसवीं शताब्दी की शुरुआत में इन विट्रो तकनीकों के विकास ने आंशिक रूप से इस लक्ष्य को हासिल किया। वर्तमान इन विट्रो तकनीकों थोड़ा है रॉक्स मूल प्रदर्शन से विकसित किया है कि भ्रूण कोशिकाओं गर्म खारा5में कई दिनों के लिए पूर्व वीवो जीवित रह सकते हैं । हालांकि, इन विट्रो पद्धतियों ज्यादातर 2-डी में खेती एकल सेल प्रकार तक ही सीमित हैं और वीवो में ऊतकों को सही ढंग से संक्षिप्त नहीं करते हैं। जबकि सेल बायोकेमिस्ट्री, फिजियोलॉजी और जेनेटिक्स की जांच के लिए उपयोगी, देशी ऊतक 3-डी हैं और कई सेल प्रकारों को शामिल करते हैं। सरल 2-डी इन विट्रो सिस्टम स्तनधारी कोशिकाओं को अत्यधिक कृत्रिम वातावरण के अधीन करता है जिसमें देशी ऊतक-विशिष्ट वास्तुकला6खो जाती है। बदले में, यह इंट्रासेलर और बाह्य घटनाओं को प्रभावित करता है, जिसके परिणामस्वरूप असामान्य कोशिका आकृति विज्ञान, शरीर विज्ञान और व्यवहार7होते हैं।
इस प्रोटोकॉल के पीछे की रुचि हाइपरट्रोफिक निशान और केलॉयड के विकास और नैदानिक प्रबंधन में निहित है। हालांकि यह अच्छी तरह से स्थापित है कि डर्मल फाइब्रोब्लास्ट निशान ऊतक में मौजूद कोलेजन के प्रचुर उत्पादन के लिए काफी हद तक जिम्मेदार हैं, 2-डी इन विट्रो सिस्टम का उपयोग करके डर्मल फाइब्रोब्लास्ट की खेती वीवो8में देखी गई कोलेजन के कारोबार को पुन: पेश करने में विफल रहता है। समकालीन इन विट्रो विधियां अभी भी अनिवार्य रूप से “गर्म खारा” का उपयोग करती हैं, जो जीवित ऊतकों में उससे पूरी तरह से अलग वातावरण है। वीवो में ऊतक बेहद भीड़ भरे होते हैं, जिसमें प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन और पॉलीसैकराइड्स होते हैं, जो कुल मात्रा का 5%-40% पर कब्जा करते हैं। चूंकि कोई भी दो अणु एक ही समय में एक ही स्थान पर कब्जा नहीं कर सकते हैं, इसलिए थोड़ा खाली स्थान उपलब्ध है और मुफ्त पानी का लगभग पूरा अभाव9है।
एमएमसी तकनीक साइटोसोल और इंटरस्टिशियल तरल पदार्थ के थर्मोडायनामिक गुणों को प्रभावित करने वाली बाधाओं को लगाती है। आणविक बातचीत, रिसेप्टर-लिगामेंट सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स, एंजाइम और ऑर्गेनेल्स स्वतंत्र रूप से बातचीत करने से सीमित हैं और9। पेरिसेलुलर वातावरण (यानी, इंटरस्टिटियम) के भीतर बातचीत भी विवश है। हाल के सबूत इस बात की पुष्टि करते हैं कि भीड़ भरे समाधानों में निष्क्रिय मैक्रोअणुओं की उच्च सांद्रता प्रसार, भौतिक संघ, चिपचिपाहट और हाइड्रोडायनामिक गुणों10को परेशान करती है।
दिलचस्प बात यह है कि कई लोकप्रिय क्राउडिंग एजेंट (यानी, फिकॉल, डीएक्सटीएन, पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन [पीवीपी], और सोडियम 4-स्टायरनेसल्फोनेट [पीएसएस]) विभिन्न सेल प्रकारों और विभिन्न सेटिंग्स में लागू होने पर समकक्ष नहीं हैं। पिछले एक अध्ययन में, Ficoll पीवीपी की तुलना में मेसेंचिमल स्टेम सेल के लिए कम साइटोटॉक्सिक होने की सूचना मिली थी । इन परिणामों की व्याख्या इसके तटस्थ आवेश और अपेक्षाकृत छोटे हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या11के परिणाम के रूप में की गई थी । इसके विपरीत, एक दूसरे अध्ययन में पाया गया कि dextran Ficoll12की तुलना में मानव फेफड़ों फाइब्रोब्लास्ट द्वारा कोलेजन मैं बयान उत्तेजक में अधिक प्रभावी है । हमारे अपने अध्ययन से डेटा से पता चलता है कि Ficoll हाइपरट्रोफिक निशान-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट द्वारा कोलेजन बयान को बढ़ाता है, जबकि PVP इन कोशिकाओं13के लिए विषाक्त है ।
यह दर्शाया गया है कि वीवो पर्यावरण14में अत्यधिक भीड़ में प्रोकोलेजन को कोलेजन का रूपांतरण तेज होता है, जबकि जैविक प्रतिक्रियाओं की दर में पतला 2-डी संस्कृति प्रणाली15में देरी होती है । हमने यहां इन विट्रो प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है, जिसमें एमएमसी को शामिल किया गया है ताकि डर्मल फाइब्रोसिस और निशान गठन के लिए अधिक “वीवो-जैसे” मॉडल के रूप में सेवारत डर्मल फाइब्रोब्लास्ट की खेती को दिखाया जा सके। आम 2-डी संस्कृति प्रणाली के विपरीत, एमएमसी के साथ एचएचएसएफ की खेती बायोसिंथेसिस और कोलेजन के जमाव को काफी13उत्तेजित करती है। विशेष रूप से, फाइब्रोसिस (यानी, मैट्रिक्स मेटलोप्रोटीनाज़ [एमएमपी] और भड़काऊ साइटोकिन्स की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति की अन्य विशेषताएं भी इस अनुकूलित एमएमसी प्रोटोकॉल13के तहत स्पष्ट हैं। जब इस विधि का उपयोग करखेती की जाती है, तो यह दिखाया जाता है कि डर्मल कोशिकाएं वीवो में मापा गया शारीरिक, जैव रासायनिक और कार्यात्मक मापदंडों को फिर से तैयार करती हैं।
ऑप्टिमाइज्ड एमएमसी इन विट्रो प्रोटोकॉल का उपयोग हाइपरट्रोफिक निशान डर्मिस और अशामिल आसन्न डर्मिस से अलग डर्मल फाइब्रोब्लास्ट द्वारा कोलेजन और अन्य ईसीएम प्रोटीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है। जब वीट्रो में एमएमसी वातावरण में खेती की जाती है, तो यह देखा गया है कि एचएचएसएफ वीवो में डर्मल हाइपरट्रोफिक निशान ऊतक के समान कुछ विशेषताओं (यानी, एमआरएनए, बायोकेमिस्ट्री, फिजियोलॉजी और फेनोटाइप) को व्यक्त करता है। सबूत इंगित करता है कि क्राउडर्स का चयन करते समय भौतिक और रासायनिक गुण महत्वपूर्ण विचार हैं और विट्रो में खेती के लिए एमएमसी की स्थिति का अनुकूलन करते हैं।
सबूत के सिद्धांत के लिए, एमएमसी प्रोटोकॉल गुणात्मक और मात्रात्मक शिकोनिन और उसके अनुरूप apoptosis प्रेरित करने की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए यहां लागू किया जाता है । यह13डर्मल जख्म के प्रबंधन के लिए इन स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न पारंपरिक चीनी चिकित्सा (TCM) यौगिकों के संभावित अनुप्रयोगों के मूल्यांकन की अनुमति देता है । बावजूद, सादगी, लागत प्रभावशीलता, और इस में विट्रो एमएमसी प्रोटोकॉल की समयबद्धता भी यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/EU और अमेरिका के पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (EPA) द्वारा स्तनधारियों में प्रयोग को खत्म करने के लिए हाल के नियमों को संतुष्ट करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मानव cutaneous निशान ऊतक के लिए विट्रो मॉडल में एक बेहतर: निशान-इन-ए-जार को अनुकूलित और प्रमाणित करना है। पिछले अध्ययनों ने मानव फेफड़े फाइब्रोब्लास्ट12,मानव अस्थि मज्जा मेस…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को विज्ञान, प्रौद्योगिकी और अनुसंधान के लिए सिंगापुर की एजेंसी से धन द्वारा समर्थित किया गया था “एसपीएफ 2013/004: त्वचा जीव विज्ञान बुनियादी अनुसंधान” और “उष्णकटिबंधीय के लिए घाव देखभाल नवाचार” भारतीय वायु सेना-पीपी/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 । लेखक कृतज्ञता से डॉ पाउला बेनी और डॉ माइकल रघुनाथ से सलाह और सहायता स्वीकार करते हैं ।
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
