高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル
Summary
このプロトコルは、高分子群行の使用を用い、生体内条件に似たヒト肥大型瘢痕組織モデルを作成することを説明する。人間の皮膚線維芽細胞は、高分子環境で栽培すると、色型、生化学、生理学、および瘢痕組織に似た機能特性を示します。
Abstract
生体内組織はタンパク質、核酸、リボヌクレオタンパク質、多糖類などによって非常に混雑することが示されています。次のプロトコルは、高分子群集(MMC)技術を適用して、体性ポリマー(群集機)をインビトロの細胞培養に添加することによってこの生理的混雑を模倣する。Ficollまたはデキストランをクラウダーとして使用した以前の研究は、MMC技術を使用してWI38およびWS-1細胞株におけるコラーゲンIおよびフィブロネクチンの発現が有意に増強されることを実証している。しかし、この技術は、一次肥大性瘢痕由来のヒト皮膚線維芽細胞(hHSF)において検証されていない。このプロトコルは、コラーゲンの過剰な沈着から肥大性瘢痕化が生じるため、hHSFを用いたMMC技術を適用することで、コラーゲンが豊富な体外肥肥性瘢痕モデルを構築することを目的としています。この最適化されたMMCモデルは、従来の2次元(2次元)細胞培養系と比較して、生体内瘢痕組織との類似性が高い点が示されている。さらに、動物モデルに比べて費用対効果が高く、時間効率が高く、倫理的に望ましいです。したがって、ここで報告される最適化モデルは、肥大性瘢痕関連研究のための高度な「生体内様」モデルを提供する。
Introduction
瘢痕組織は、組織修復の終点を表す。しかし、多くの個人、特に火傷や外傷1に苦しむ人では、瘢痕化が過剰であり、治癒した皮膚の形態および機能に望ましくない影響を及ぼす可能性がある。病理的(肥大性瘢痕およびケロイド)瘢痕形成の正確なメカニズムは十分には理解されていないが、創傷治癒時のコラーゲンの過剰な沈着が必須の寄与である2であることが実証された。
成長因子β1(TGF-β1)とα平滑筋アクチン(αSMA)の変換が肥大性瘢痕の形成において重要な役割を果たすのは十分に確立されている。証拠は、上昇したTGF-β1がSMADシグナル伝達経路3を調節することによってコラーゲンの過剰な沈着を直接刺激することを示唆している。また、αSMAは創傷治癒過程4において細胞収縮や再形成を調節することにより肥大性瘢痕形成に寄与することが分かった。インビトロおよびインビボモデルの適切な欠如は、瘢痕修復のための介入および治療法の開発と評価に対する大きな障害である。本研究の目的は、既存のMMC技術を利用して、新たな瘢痕関連の介入を評価するのに適した「生体内に似た」肥大性瘢痕モデルを構築することである。
体外の生体組織を再現する、科学界では何年もの間の目標となってきました。20世紀初頭のインビトロ技術の開発は、この目標を部分的に達成しました。現在のインビトロ技術は、胚細胞が暖かい生理食動物5で数日間生き残ることができるというルーの当初の実証からわずかに進化した。しかし、in vitroの方法論は、主に2次元で培養された単一細胞型に限定され、生体内の組織を正確に再現しない。細胞生化学、生理学、遺伝学を調べるのに役立ちますが、ネイティブ組織は3次元であり、複数の細胞タイプを組み込んでいます。単純な2次元インビトロシステムは、哺乳類細胞を、ネイティブの組織特異的なアーキテクチャが失われる高度に人工的な環境に供する6.これは細胞内および細胞外の事象に影響を及ぼし、細胞の形態、生理学、および行動7に異常をもたらす。
このプロトコルの背後にある関心は、肥大性瘢痕およびケロイドの開発および臨床管理にある。皮膚線維芽細胞が瘢痕組織に存在するコラーゲンの豊富な産生を主に担うことは定評があるが、2次元インビトロ系を用いて皮膚線維芽細胞を培養することは、生体内8で観察されたコラーゲンのターンオーバーを再現することができない。現代のインビトロ法は、生きている組織とは全く異なる環境である「温かい生理学」を依然として本質的に使用しています。生体内の組織は非常に混雑しており、タンパク質、核酸、リボヌクレオタンパク質、多糖類が総容積の5~40%を占めています。2つの分子が同時に同じ空間を占有することはできないので、利用可能な空きスペースはほとんどなく、水のほとんど完全な欠如9。
MMC技術は、細胞質ゾルおよび間質流体の熱力学的特性に影響を与える制約を課す。分子相互作用、受容体リガンドシグナル伝達複合体、酵素、およびオルガネラは、閉じ込められ、自由に相互作用することから制限される9.細胞内環境(すなわち、インタースティジウム)内の相互作用もまた制約される。最近の証拠は、混和溶液中の高濃度の不活性高分子が拡散を摂動し、物理的な関連、粘度および流体力学的特性10を摂動することを確認している。
興味深いことに、いくつかの一般的な混雑剤(すなわち、フィコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン[PVP]、および4-スチレンスルホン酸ナトリウム[PSS])は、異なる細胞タイプおよび異なる設定に適用すると同等ではない。ある以前の研究では、FicollはPVPと比較して間葉系幹細胞の細胞毒性が低いことが報告されました。これらの結果は、その中性電荷と比較的小さい流体力学的半径11の結果であると解釈された。対照的に、第2の研究は、dextranがFicoll12と比較してヒト肺線維芽細胞によるコラーゲンI沈着を刺激するのにより効果的であることを発見した。我々自身の研究からのデータは、Ficollが肥大性瘢痕由来線維芽細胞によるコラーゲン沈着を増強するのに対し、PVPはこれらの細胞13に対して毒性があることを示唆している。
インビボ環境14では非常に混雑している間にコラーゲンへのプロコラーゲンの変換が速く、希釈された2次元培養系15では生物学的反応速度が遅れることが実証されている。ここでは、MMCを組み込んで、真皮線維症および瘢痕形成のより「インビボ様」モデルとしての役割を果たすように、in vitroプロトコルを最適化しました。一般的な2次元培養系とは対照的に、MMCでhHSFを栽培することは、コラーゲンの生合成および沈着を有意に刺激する13。特に、線維化の他の特徴(すなわち、マトリックスメタロプロテイナーゼ[MmPs]および炎症性サイトカインの発現の増加)も、この最適化されたMMCプロトコル13の下でも明らかである。この方法を用いて培養した場合、真皮細胞が生体内で測定した生理学的、生化学的、および機能的なパラメータを再現することが示される。
最適化されたMMC in vitroプロトコルは、肥大性瘢痕真皮および関係のない隣接する真皮から分離された真皮線維芽細胞によってコラーゲンおよび他のECMタンパク質の発現を評価するために使用されてきた。生体外のMMC環境で栽培した場合、hHSFが生体内の真皮肥大性瘢痕組織と同様に特定の特徴(すなわち、mRNA、生化学、生理学、および表現型)を発現することが観察されている。この証拠は、群集を選択し、体外栽培のためのMMC条件を最適化する際に、物理的および化学的特性が重要な考慮事項であることを示している。
原理の証明のために、MMCプロトコルは、シコニンとその類似体がアポトーシスを誘導する能力を定性的かつ定量的に評価するために、ここで適用される。これにより、真皮瘢痕13を管理するためのこれらの天然由来の伝統的な中国医学(TCM)化合物の潜在的な用途の評価が可能になる。それにもかかわらず、このインビトロMMCプロトコルのシンプルさ、費用対効果、適時性は、EU指令2010/63/EUおよび米国環境保護庁(EPA)による哺乳類の実験を排除するための最近の規制も満たしています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、人間の皮瘢痕組織の改良された:scar-in-a-jar”in vitroモデルを最適化し、認証することを目的としています。これまでの研究では、ヒト肺線維芽細胞12、ヒト骨髄間葉幹細胞23、およびヒト真皮線維芽細胞23に対するMMC技術の応用が報告されており、デキストラン12、Ficoll12、および12<sup cla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、シンガポール科学技術庁「SPF 2013/004:皮膚生物学基礎研究」と「熱帯地方創傷ケアイノベーション」IAF-PP/2017(HBMS)H17/01/01/a0/009からの資金提供によって支えられました。著者らは、ポーラ・ベニー博士とマイケル・ラグナート博士からの助言と支援を感謝しています。
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
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