Modelo in vitro de cicatrizes hipertróficas cutâneas humanas usando aglomeração macromolecular
Summary
Este protocolo descreve o uso de aglomeração macromolecular para criar um modelo de tecido de cicatrizes hipertróficas hipertróficas in vitro humano que se assemelha a condições in vivo. Quando cultivados em um ambiente macromolecular lotado, os fibroblastos da pele humana exibem fenótipos, bioquímica, fisiologia e características funcionais semelhantes ao tecido cicatricial.
Abstract
Foi demonstrado que os tecidos in vivo são altamente lotados por proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas, polissacarídeos, etc. O protocolo a seguir aplica uma técnica de aglomeração macromolecular (MMC) para imitar essa aglomeração fisiológica através da adição de polímeros neutros (crowders) às culturas celulares in vitro. Estudos anteriores usando Ficoll ou dextran como crowders demonstram que a expressão de colágeno I e fibronectina em linhas celulares WI38 e WS-1 são significativamente melhoradas usando a técnica MMC. No entanto, essa técnica não foi validada em fibroblastos de pele humana derivados de cicatrizes hipertróficas primárias (hHSFs). Como a cicatriz hipertrófica surge da deposição excessiva de colágeno, este protocolo visa construir um modelo de cicatriz hipertrófica in vitro rico em colágeno, aplicando a técnica mmc com hHSFs. Este modelo otimizado de MMC tem mostrado possuir mais semelhanças com o tecido in vivo cicatriz em comparação com os sistemas tradicionais de cultura celular bidimensional (2-D). Além disso, é econômico, econômico e eticamente desejável em comparação com modelos animais. Portanto, o modelo otimizado aqui relatado oferece um modelo avançado “in vivo” para estudos hipertróficos relacionados à cicatriz.
Introduction
O tecido cicatricial representa o ponto final da reparação tecidual. No entanto, em muitos indivíduos, especialmente aqueles que sofrem de queimaduras outraumas 1, cicatrizes podem ser excessivas e impor efeitos indesejáveis sobre a morfologia e o funcionamento da pele curada. Embora os mecanismos exatos da formação de cicatrizes patológicas (hipertróficas e quelóides) não sejam totalmente compreendidos, a deposição excessiva de colágeno durante a cicatrização de feridas tem sido demonstrada como uma contribuição essencial2.
Está bem estabelecido que a transformação do fator de crescimento beta 1 (TGF-β1) e a actina muscular alfa lisa (αSMA) desempenham papéis-chave na formação de cicatrizes hipertróficas. As evidências sugerem que o TGF-β1 elevado estimula diretamente a deposição excessiva de colágeno através da regulação da via de sinalização SMAD3. Além disso, verificou-se que αSMA contribui para a formação de cicatrizes hipertróficas, regulando a contração celular e a reepitelalização no processo de cicatrização da ferida4. A falta de modelos in vitro e in vivo adequados é um grande impedimento para o desenvolvimento e avaliação de intervenções e terapias para remediação de cicatrizes. O objetivo deste estudo é utilizar a técnica existente de MMC para construir um modelo de cicatriz hipertrófica “in vivo” adequado para avaliar intervenções novas e emergentes relacionadas à cicatriz.
Reproduzir tecido vivo fora do corpo tem sido uma meta há anos na comunidade científica. O desenvolvimento de técnicas in vitro no início do século XX atingiu parcialmente esse objetivo. As técnicas in vitro atuais evoluíram ligeiramente da demonstração original de Roux de que as células embrionárias podem sobreviver ex vivo por vários dias em soro quente5. No entanto, as metodologias in vitro são limitadas principalmente a tipos de células únicas cultivadas em 2-D e não recapitularem tecidos in vivo com precisão. Embora úteis para examinar a bioquímica celular, fisiologia e genética, os tecidos nativos são 3D e incorporam vários tipos de células. Sistemas in vitro simples 2-D submetem células mamíferas a ambientes altamente artificiais nos quais a arquitetura nativa específica do tecido é perdida6. Por sua vez, isso afeta eventos intracelulares e extracelulares, resultando em morfologia celular anormal, fisiologia e comportamento7.
O interesse por trás desse protocolo está no desenvolvimento e manejo clínico de cicatrizes hipertróficas e quelóides. Embora esteja bem estabelecido que os fibroblastos dérmicos são em grande parte responsáveis pela produção abundante de colágenos presentes no tecido cicatricial, o cultivo de fibroblastos dérmicos utilizando sistemas in vitro 2-D não consegue reproduzir o volume de negócios de colágeno observado in vivo8. Métodos in vitro contemporâneos ainda usam essencialmente “soro fisiológico quente”, um ambiente completamente diferente daquele dos tecidos vivos. Os tecidos in vivo são extremamente aglomerados, com proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas e polissacarídeos, ocupando 5%-40% do volume total. Como nenhuma molécula pode ocupar o mesmo espaço ao mesmo tempo, há pouco espaço livre disponível e uma ausência quase completa de água livre9.
A técnica mmc impõe restrições que afetam as propriedades termodinâmicas de citostes e fluidos intersticiais. Interações moleculares, complexos de sinalização receptor-ligantes, enzimas e organelas estão confinadas e restritas de interagir livremente9. As interações dentro do ambiente pericelular (ou seja, interstício) também são restritas. Evidências recentes confirmam que altas concentrações de macromoléculas inertes em soluções lotadas perturbam a difusão, associação física, viscosidade e propriedades hidrodinâmicas10.
Curiosamente, vários agentes populares de aglomeração (ou seja, Ficoll, dextran, polivinilpirrorolido [PVP], e sódio 4-estirenosulfonato [PSS]) não são equivalentes quando aplicados a diferentes tipos de células e em diferentes configurações. Em um estudo anterior, Ficoll foi relatado como menos citotóxico para células-tronco mesenquimais em comparação com PVP. Esses resultados foram interpretados como conseqüência de sua carga neutra e do raio hidrodinâmico relativamente pequeno11. Em contraste, um segundo estudo descobriu que dextran é mais eficaz em estimular a deposição de colágeno I por fibroblastos pulmonares humanos em comparação com Ficoll12. Dados de nosso próprio estudo sugerem que Ficoll aumenta a deposição de colágeno por fibroblastos hipertróficos derivados de cicatrizes, enquanto pvp é tóxico para essas células13.
Foi demonstrado que a conversão de procolágeno para colágeno é mais rápida em um ambiente in vivo altamente lotado14, enquanto a taxa de reações biológicas é retardada em um sistema de cultura 2D diluído15. Otimizamos o protocolo in vitro aqui, incorporando o MMC para mostrar o cultivo de fibroblastos dérmicos servindo como um modelo mais “in vivo” para fibrose dérmica e formação de cicatrizes. Em contraste com o sistema de cultura 2D comum, cultivar hHSFs com MMC estimula significativamente a biossíntese e a deposição do colágeno13. Notavelmente, outras características da fibrose (ou seja, aumento da expressão das metaloproteinases matriciais [MMPs] e citocinas proinflamatórias) também são evidentes sob este protocolo otimizado de McMc13. Quando cultivadas usando este método, mostra-se que as células dérmicas recapitulam os parâmetros fisiológicos, bioquímicos e funcionais medidos in vivo.
O protocolo in vitro otimizado do MMC tem sido utilizado para avaliar a expressão de colágeno e outras proteínas de ECM por fibroblastos dérmicos isolados da derme de cicatriz hipertrófica e derme adjacente não envolvido. Quando cultivados em ambientes de MMC in vitro, observou-se que os HHSFs expressam certas características (ou seja, mRNA, bioquímica, fisiologia e fenótipo) semelhantes ao tecido cicatrizhipertrófico dérmico in vivo. As evidências indicam que propriedades físicas e químicas são considerações importantes ao selecionar crowders e otimizar as condições de MMC para cultivo in vitro.
Para a prova de princípio, o protocolo MMC é aplicado aqui para avaliar qualitativamente e quantitativamente a capacidade de Shikonin e seus análogos para induzir a apoptose. Isso permite avaliar as aplicações potenciais desses compostos de Medicina Tradicional Chinesa (TCM) naturalmente derivados para o gerenciamento de cicatrizes dérmicas13. Não obstante, a simplicidade, a eficácia e a pontualidade deste protocolo In vitro MMC também satisfaz regulamentos recentes para eliminar a experimentação em mamíferos pela Diretiva DA UE 2010/63/UE e pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo visa otimizar e autenticar um modelo in vitro melhorado de “cicatriz-em-um-frasco” para tecido cicatrizado humano. Estudos anteriores relataram a aplicação da técnica MMC aos fibroblastos pulmonares humanos12, células-tronco mesenquimais de medula óssea humana23, e fibroblastos dérmicos humanos23 usando dextran12, Ficoll12, e PVP23 como crowders. No estudo aq…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa de Cingapura “SPF 2013/004: Pesquisa Básica em Biologia da Pele” e do “Wound Care Innovation for the Tropics” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Os autores agradecem conselhos e assistência da Dra.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
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