В vitro Модель человека кожные гипертрофические рубцы с помощью макромолекулярной crowding
Summary
Этот протокол описывает использование макромолекулярной скученности для создания в пробирке человеческой гипертрофической модели рубцовой ткани, которая напоминает условия in vivo. При выращивании в переполненной макромолекулярной среде фибробласты кожи человека демонстрируют фенотипы, биохимию, физиологию и функциональные характеристики, напоминающие рубцовую ткань.
Abstract
Было показано, что ткани in vivo очень переполнены белками, нуклеиновыми кислотами, рибонуклеопротеитами, полисахаридами и т.д. Следующий протокол применяет макромолекулярную методика скученности (MMC), чтобы имитировать эту физиологическую скученность через добавление нейтральных полимеров (краудеров) к клеточным культурам in vitro. Предыдущие исследования с использованием Ficoll или dextran в качестве краудтеров показывают, что выражение коллагена I и фибронектина в линиях клеток WI38 и WS-1 значительно усиливается с помощью метода MMC. Тем не менее, этот метод не был проверен в первичных гипертрофических рубцов полученных человеческих фибробластов кожи (hHSFs). Как гипертрофические рубцы возникает из-за чрезмерного осаждения коллагена, этот протокол направлен на создание коллагена богатых в пробирке гипертрофической модели рубца, применяя технику MMC с hHSFs. Эта оптимизированная модель MMC, как было показано, обладает большим сходством с рубцовой тканью in vivo по сравнению с традиционными 2-мерными (2-D) системами клеточной культуры. Кроме того, это экономически эффективным, экономичным и этически желательным по сравнению с животными моделями. Таким образом, оптимизированная модель сообщила здесь предлагает передовые “виво-как” модель для гипертрофических рубцов, связанных исследований.
Introduction
Рубцовая ткань представляет собой конечную точку восстановления тканей. Тем не менее, у многих людей, особенно тех, кто страдает от ожогов или травм1, рубцы могут быть чрезмерными и налагать нежелательное воздействие на морфологию и функционирование исцелил кожи. Хотя точные механизмы патологических (гипертрофические рубцы и келоиды) образование рубцов не до конца изучены, чрезмерное осаждение коллагена во время заживления ран было продемонстрировано, чтобы быть существенным вкладом2.
Хорошо известно, что преобразование фактора роста бета 1 (TGF-No1) и альфа-гладкий мышечный актин (ЗСМА) играют ключевую роль в формировании гипертрофированного рубцов. Фактические данные свидетельствуют о том, что повышенный TGF-No1 непосредственно стимулирует чрезмерное осаждение коллагена через регулирование сигнального пути SMAD3. Кроме того, было установлено, что ЗСМА способствует гипертрофическому образованию рубцов, регулируя сокращение клеток и репиттелилиализацию в процессе заживления ран4. Отсутствие подходящих моделей in vitro и in vivo является основным препятствием на пути разработки и оценки мероприятий и методов лечения рубцов. Цель этого исследования заключается в использовании существующей техники MMC для создания “виво-как” гипертрофические рубцовая модель, которая подходит для оценки новых и возникающих рубцов, связанных с вмешательствами.
Воспроизводство живой ткани вне тела было целью в течение многих лет в научном сообществе. Развитие методов in vitro в начале ХХ века частично достигло этой цели. Текущие методы in vitro слегка эволюционировали от первоначальной демонстрации Ру, что эмбриональные клетки могут выжить ex vivo в течение нескольких дней в теплом сольнике5. Тем не менее, методологии in vitro в основном ограничиваются одноклеточными типами, культивируемыми в 2-D, и не точно переизглажают ткани in vivo. Хотя полезно для изучения биохимии клеток, физиологии и генетики, родные ткани 3-D и включают несколько типов клеток. Простые 2-D системы in vitro подвергают клетки млекопитающих высокоискусственной среде, в которой родная ткань-специфическая архитектура теряется6. В свою очередь, это влияет на внутриклеточные и внеклеточные события, в результате чего аномальные морфологии клеток, физиологии и поведения7.
Интерес к этому протоколу лежит в разработке и клиническом ведении гипертрофированными рубцов и келоидов. Хотя хорошо установлено, что дермальные фибробласты в значительной степени ответственны за обильное производство коллагенов, присутствующих в рубцовой ткани, культивирование кожных фибробластов с использованием 2-D в пробирке систем не может воспроизвести оборот коллагена наблюдается в vivo8. Современные методы in vitro по-прежнему по существу используют “теплый солин”, среду, полностью отличающаяся от среды в живых тканях. Ткани in vivo чрезвычайно переполнены, с белками, нуклеиновыми кислотами, рибонуклеопротеитами и полисахаридами, занимающими 5%-40% от общего объема. Поскольку ни одна из двух молекул не может занимать одно и то же пространство одновременно, свободного пространства мало и почти полное отсутствие свободной воды9.
Метод MMC налагает ограничения, влияющие на термодинамические свойства цитозола и интерстициальных жидкостей. Молекулярные взаимодействия, рецептор-лиганд сигнальные комплексы, ферменты и органеллы ограничены и ограничены от свободного взаимодействия9. Взаимодействия в периклеарной среде (т.е. интерститиум) также ограничены. Последние данные подтверждают, что высокие концентрации инертных макромолекулов в переполненных растворах возмущения диффузии, физической ассоциации, вязкости и гидродинамических свойств10.
Интересно, что несколько популярных агентов скученности (нат., Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidone »PVP» и натрий 4-styrenesulfonate »PSS») не эквивалентны при применении к различным типам клеток и в различных условиях. В одном предыдущем исследовании, Фиколл, как сообщается, менее цитотоксических для мезенхимальных стволовых клеток по сравнению с PVP. Эти результаты были интерпретированы как следствие его нейтрального заряда и относительно небольшого гидродинамического радиуса11. В отличие от этого, второе исследование показало, что декектин является более эффективным в стимулировании коллагена Я осаждения человека фибробластов легких по сравнению с Ficoll12. Данные нашего собственного исследования показывают, что Фиколл усиливает осаждение коллагена гипертрофированными рубцовами фибробластов, в то время как PVP является токсичным для этих клеток13.
Было продемонстрировано, что преобразование проколлагена в коллаген быстрее в очень переполненном in vivo окружающей среды14, в то время как скорость биологических реакций задерживается в разбавленной 2-D культуры системы15. Мы оптимизировали протокол in vitro здесь, включая MMC, чтобы показать выращивание кожных фибробластов, служащих в качестве более “виво-подобной” модели дермального фиброза и образования рубцов. В отличие от общей 2-D культуры системы, культивирование hHSFs с MMC стимулирует биосинтез и осаждение коллагена значительно13. Примечательно, что в этом оптимизированном протоколе MMC13проявляются и другие характеристики фиброза (т.е. повышенная экспрессия матричных металлопротеиназ и провоспалительных цитокинов). При выращивании с помощью этого метода, показано, что дермальные клетки резюмируют физиологические, биохимические и функциональные параметры, измеренные в vivo.
Оптимизированный протокол MMC in vitro был использован для оценки экспрессии коллагена и других белков ECM дермическими фибробластами, изолированными от гипертрофических рубцовой дермы и невовлеченной смежной дермы. При выращивании в средах MMC in vitro было отмечено, что hHSFs выражают определенные характеристики (т.е. мРНК, биохимия, физиология и фенотип), похожие на дермальные гипертрофические рубцовые ткани in vivo. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что физические и химические свойства являются важными соображениями при выборе сеулеров и оптимизации условий MMC для выращивания в пробирке.
Для доказательства принципа здесь применяется протокол MMC для качественной и количественной оценки способности Шиконина и его аналогов вызывать апоптоз. Это позволяет оценить потенциальные применения этих естественно полученных традиционной китайской медицины (TCM) соединений для управления кожные рубцы13. Несмотря на это, простота, рентабельность и своевременность этого протокола in vitro MMC также удовлетворяет недавние правила по ликвидации экспериментов на млекопитающих директивой ЕС 2010/63/EU и Агентством по охране окружающей среды США (EPA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол направлен на оптимизацию и аутентификации улучшенной модели in-scar-in-a-jar для человеческой кожной рубцовой ткани. Предыдущие исследования сообщили о применении метода MMC для человека фибробластов легких12, человеческий костный мозг мезенхимальных стволовых кле…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансированием из Сингапура Агентство по науке, технологиям и исследованиям “SPF 2013/004: Биология кожи Основные исследования” и “Wound Care Инновации для тропиков” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Авторы с благодарностью признают советы и помощь д-ра Паулы Бенни и д-ра Майкла Рагхунатха.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
