Modelo In Vitro de Cicatrices Hipertróficas Cutáneas Humanas usando Crowding Macromolecular
Summary
Este protocolo describe el uso de aglomeración macromolecular para crear un modelo de tejido cicatricial humano in vitro que se asemeja a condiciones in vivo. Cuando se cultivan en un ambiente macromolecular lleno de gente, los fibroblastos de la piel humana exhiben fenotipos, bioquímica, fisiología y características funcionales que se asemejan al tejido cicatricial.
Abstract
Se ha demostrado que los tejidos in vivo están muy llenos de proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas, polisacáridos, etc. El siguiente protocolo aplica una técnica de aglomeración macromolecular (MMC) para imitar este hacinamiento fisiológico mediante la adición de polímeros neutros (crowders) a cultivos celulares in vitro. Estudios previos con Ficoll o dextran como crowders demuestran que la expresión de colágeno I y fibronectina en las líneas celulares WI38 y WS-1 se mejoran significativamente mediante la técnica MMC. Sin embargo, esta técnica no ha sido validada en fibroblastos primarios de piel humana derivados de cicatrices hipertróficas (hHSF). A medida que la cicatrización hipertrófica surge de la excesiva deposición de colágeno, este protocolo tiene como objetivo construir un modelo de cicatriz hipertrófica in vitro rico en colágeno mediante la aplicación de la técnica MMC con hHSFs. Se ha demostrado que este modelo MMC optimizado posee más similitudes con el tejido cicatricial in vivo en comparación con los sistemas tradicionales de cultivo celular de 2 dimensiones (2-D). Además, es rentable, eficiente en el tiempo y éticamente deseable en comparación con los modelos animales. Por lo tanto, el modelo optimizado reportado aquí ofrece un modelo avanzado “in vivo-como” para estudios hipertróficos relacionados con la cicatriz.
Introduction
El tejido cicatricial representa la variable de reparación del tejido. Sin embargo, en muchos individuos, especialmente aquellos que sufren de quemaduras o trauma1, las cicatrices pueden ser excesivas e imponer efectos indeseables en la morfología y el funcionamiento de la piel curada. Aunque no se entienden completamente los mecanismos exactos de la formación patológica (cicatrices hipertróficas y queloides), la deposición excesiva de colágeno durante la cicatrización de heridas ha demostrado ser una contribución esencial2.
Está bien establecido que la transformación del factor de crecimiento beta 1 (TGF–1) y la actina muscular alfa suave (SMA) desempeñan un papel clave en la formación de cicatrices hipertróficas. La evidencia sugiere que el TGF-1 elevado estimula directamente la deposición excesiva de colágeno a través de la regulación de la vía de señalización SMAD3. Además, se ha encontrado que la ASMA contribuye a la formación de cicatrices hipertróficas mediante la regulación de la contracción celular y la reepitelización en el proceso de cicatrización de heridas4. La falta de modelos in vitro e in vivo adecuados es un impedimento importante para desarrollar y evaluar intervenciones y terapias para la remediación de cicatrices. El objetivo de este estudio es utilizar la técnica MMC existente para construir un modelo de cicatrices hipertróficas “in vivo-like” que sea adecuado para evaluar intervenciones novedosas y emergentes relacionadas con las cicatrices.
Reproducir tejido vivo fuera del cuerpo ha sido un objetivo durante años en la comunidad científica. El desarrollo de técnicas in vitro a principios del siglo XX logró en parte este objetivo. Las técnicas in vitro actuales han evolucionado ligeramente a partir de la demostración original de Roux de que las células embrionarias pueden sobrevivir ex vivo durante varios días en la salina caliente5. Sin embargo, las metodologías in vitro se limitan principalmente a los tipos de células simples cultivadas en 2-D y no recapitulan con precisión los tejidos in vivo. Si bien son útiles para examinar la bioquímica celular, la fisiología y la genética, los tejidos nativos son tridimensionales e incorporan múltiples tipos de células. Los sistemas in vitro 2D simples someten las células de mamíferos a entornos altamente artificiales en los que se pierde la arquitectura específica del tejido nativo6. A su vez, esto afecta a los eventos intracelulares y extracelulares, lo que resulta en morfología celular anormal, fisiología y comportamiento7.
El interés de este protocolo radica en el desarrollo y manejo clínico de cicatrices y queloides hipertróficos. Si bien está bien establecido que los fibroblastos dérmicos son en gran parte responsables de la abundante producción de colágenos presentes en el tejido cicatricial, el cultivo de fibroblastos dérmicos utilizando sistemas in vitro 2-D no reproduce la rotación de colágeno observada in vivo8. Los métodos in vitro contemporáneos todavía utilizan esencialmente “salina caliente”, un ambiente completamente diferente al de los tejidos vivos. Los tejidos in vivo están extremadamente concurridos, con proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas y polisacáridos, ocupando entre el 5% y el 40% del volumen total. Como no hay dos moléculas pueden ocupar el mismo espacio al mismo tiempo, hay poco espacio libre disponible y una ausencia casi completa de agua libre9.
La técnica MMC impone restricciones que afectan a las propiedades termodinámicas del citosol y los fluidos intersticiales. Las interacciones moleculares, los complejos de señalización receptor-ligand, las enzimas y los orgánulos están confinados y restringidos a interactuar libremente9. Las interacciones dentro del entorno pericelular (es decir, intersticio) también están limitadas. La evidencia reciente confirma que las altas concentraciones de macromoléculas inertes en soluciones abarrotadas perturban la difusión, asociación física, viscosidad y propiedades hidrodinámicas10.
Curiosamente, varios agentes de aglomeración populares (es decir, Ficoll, dextran, polivinilpirrolidona [PVP] y sodio 4-estirenosulfonato [PSS]) no son equivalentes cuando se aplican a diferentes tipos de células y en diferentes configuraciones. En un estudio anterior, Se informó que Ficoll era menos citotóxico para las células madre mesenquimales en comparación con la PVP. Estos resultados fueron interpretados como la consecuencia de su carga neutra y el radio hidrodinámico relativamente pequeño11. Por el contrario, un segundo estudio encontró que el deextran es más eficaz en la estimulación de la deposición de colágeno I por fibroblastos pulmonares humanos en comparación con Ficoll12. Los datos de nuestro propio estudio sugieren que Ficoll mejora la deposición de colágeno por fibroblastos derivados de cicatrices hipertróficas, mientras que la PVP es tóxica para estas células13.
Se ha demostrado que la conversión de procolágeno a colágeno es más rápida en un ambiente in vivo altamente concurrido14,mientras que la tasa de reacciones biológicas se retrasa en un sistema de cultivo 2D diluido15. Hemos optimizado el protocolo in vitro aquí, incorporando MMC para mostrar el cultivo de fibroblastos dérmicos sirviendo como un modelo más “in vivo-como” para fibrosis dérmica y formación de cicatrices. En contraste con el sistema de cultivo 2D común, el cultivo de hHSFcon MMC estimula significativamente la biosíntesis y la deposición de colágeno13. En particular, otras características de la fibrosis (es decir, el aumento de la expresión de la matriz de metaloproteinasas [MMP] y citoquinas proinflamatorias) también son evidentes bajo este protocolo MMC optimizado13. Cuando se cultiva utilizando este método, se muestra que las células dérmicas recapitulan los parámetros fisiológicos, bioquímicos y funcionales medidos in vivo.
El protocolo MMC in vitro optimizado se ha utilizado para evaluar la expresión de colágeno y otras proteínas ECM por fibroblastos dérmicos aislados de la dermis de cicatrices hipertróficas y la dermis adyacente no implicada. Cuando se cultiva en entornos MMC in vitro, se ha observado que los hHSF expresan ciertas características (es decir, ARNm, bioquímica, fisiología y fenotipo) similares al tejido cicatricial hipertrófico dérmico in vivo. La evidencia indica que las propiedades físicas y químicas son consideraciones importantes a la hora de seleccionar crowders y optimizar las condiciones MMC para el cultivo in vitro.
Para la prueba de principio, el protocolo MMC se aplica aquí para evaluar cualitativa y cuantitativamente la capacidad de Shikonin y sus análogos para inducir la apoptosis. Esto permite evaluar las posibles aplicaciones de estos compuestos de medicina tradicional china (TCM) de origen natural para la gestión de cicatrices dérmicas13. No obstante, la simplicidad, la rentabilidad y la puntualidad de este protocolo MMC in vitro también satisfacen las regulaciones recientes para eliminar la experimentación en mamíferos por la Directiva 2010/63/UE y la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) de la UE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo tiene como objetivo optimizar y autenticar un modelo in vitro mejorado :scar-in-a-jar” para el tejido cicatricial cutáneo humano. Estudios anteriores han informado de la aplicación de la técnica MMC a los fibroblastos pulmonares humanos12, células madre mesenquimales de médula ósea humana23,y fibroblastos dérmicos humanos23 utilizando dextran12,Ficoll12y PVP23</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la financiación de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur “SPF 2013/004: Investigación Básica de La Biología de la Piel” y la “Innovación para el Cuidado de la Herida para los Trópicos” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Los autores agradecen el asesoramiento y la asistencia de la Dra. Paula Benny y la Dra. Michael Raghunath.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
