Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli
Summary
Bu protokol, in vivo koşullarına benzeyen bir in vitro insan hipertrofik skar dokusu modeli oluşturmak için makromoleküler kalabalık kullanımını açıklar. Kalabalık bir makromoleküler ortamda ekili zaman, insan deri fibroblastlar fenotipleri, biyokimya, fizyoloji ve skar dokusu andıran fonksiyonel özellikleri sergiler.
Abstract
İnvivo dokuların proteinler, nükleik asitler, ribonükleoproteinler, polisakkaritler vb. ile çok kalabalık olduğu gösterilmiştir. Aşağıdaki protokol, nötr polimerlerin (crowders) hücre kültürlerine in vitro eklenmesi yle bu fizyolojik kalabalığı taklit etmek için makromoleküler bir kalabalık (MMC) tekniğini uygular. Ficoll veya dextran’ı crowder olarak kullanan önceki çalışmalar, WI38 ve WS-1 hücre hatlarında kollajen I ve fibronektin ekspresyonunun MMC tekniği kullanılarak önemli ölçüde geliştirildigini göstermektedir. Ancak, bu teknik primer hipertrofik skar kaynaklı insan deri fibroblastlarında (hHSFs) doğrulanmamıştır. Hipertrofik yara kollajenaşırı birikimi ortaya çıktığından, bu protokol hHSFs ile MMC tekniği uygulanarak kollajen açısından zengin in vitro hipertrofik skar modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu optimize MMC modeli geleneksel 2 boyutlu (2-B) hücre kültür sistemleri ile karşılaştırıldığında in vivo skar dokusu ile daha fazla benzerlikler sahip olduğu gösterilmiştir. Buna ek olarak, hayvan modellerine göre uygun maliyetli, zaman-etkin ve etik olarak arzu edilir. Bu nedenle, burada bildirilen optimize edilmiş model hipertrofik skar ile ilgili çalışmalar için gelişmiş bir “in vivo benzeri” modeli sunuyor.
Introduction
Yara dokusu doku onarımının bitiş noktasını temsil eder. Ancak, birçok kişide, özellikle yanık veyatravma1 muzdarip olanlar, yara izi aşırı olabilir ve morfolojisi ve iyileşmiş cildin işleyişi üzerinde istenmeyen etkileri empoze. Patolojik (hipertrofik yara izleri ve keloidler) skar oluşumunun tam mekanizmaları tam olarak anlaşılamamasına rağmen, yara iyileşmesi sırasında kollajenin aşırı birikiminin önemli bir katkı olduğu gösterilmiştir2.
Transforming büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) ve alfa düz kas aktininin (αSMA) hipertrofik yaraların oluşumunda kilit rol oynadığı iyi belirlenmiştir. Kanıtlar, yüksek TGF-β1’in SMAD sinyal yolu3’üdüzenleyerek kollajenin aşırı birikimini doğrudan uyardığını göstermektedir. Buna ek olarak αSMA’nın yara iyileşme sürecinde hücre daralması ve reepitelizasyonunu düzenleyerek hipertrofik skar oluşumuna katkıda bulunduğu bulunmuştur4. Uygun in vitro ve in vivo modellerin in eksikliği, yara izi İyileştirme için müdahalelerin ve tedavilerin geliştirilmesi ve değerlendirilmesi açısından önemli bir engeldir. Bu çalışmanın amacı, yeni ve ortaya çıkan yara ile ilgili müdahaleleri değerlendirmek için uygun olan “in vivo benzeri” hipertrofik skar modeli oluşturmak için mevcut MMC tekniğini kullanmaktır.
Canlı dokuların vücut dışında üretilmesi bilim camiasında yıllardır bir hedef olmuştur. Yirminci yüzyılın başlarında in vitro tekniklerinin geliştirilmesi kısmen bu hedefe ulaşıldı. Mevcut in vitro teknikleri biraz Roux orijinal gösteri embriyonik hücrelerin sıcak tuzlu5birkaç gün için ex vivo hayatta olabilir gelişti . Ancak in vitro metodolojiler çoğunlukla 2-B’de yetiştirilen tek hücreli tiplerle sınırlıdır ve in vivo dokuları doğru bir şekilde özetlemez. Hücre biyokimyası, fizyolojisi ve genetiğinin incelenmesinde yararlı olmakla birlikte, yerli dokular 3-B’dir ve birden fazla hücre tipini içerir. Basit 2-D in vitro sistemler memeli hücrelerini doğal dokuya özgü mimarinin6’sınıkaybettiği son derece yapay ortamlara tabi tutar. Buna karşılık, bu anormal hücre morfolojisi, fizyolojisi ve davranış7sonuçlanan, hücre içi ve hücre dışı olayları etkiler.
Bu protokolün arkasındaki ilgi hipertrofik yara ve keloidlerin gelişimi ve klinik yönetiminde yatsın. Dermal fibroblastların skar dokusunda bulunan kollajenlerin bol miktarda üretilmesinden büyük ölçüde sorumlu olduğu iyi saptanmış olsa da, 2-D in vitro sistemleri kullanılarak dermal fibroblastların yetiştirilmesi in vivo8’degözlenen kollajenin cirosunu yeniden üretememektedir. Çağdaş in vitro yöntemleri hala aslında “sıcak tuzlu” kullanmak, bir ortamda tamamen canlı dokularda farklı. Vivo’daki dokular proteinler, nükleik asitler, ribonükleoproteinler ve polisakkaritlerle son derece kalabalıktır ve toplam hacmin %5-40’ını kaplarlar. Hiçbir iki molekül aynı anda aynı alanı işgal edebilirsiniz gibi, çok az boş alan mevcut ve serbest su neredeyse tam yokluğu9.
MMC tekniği, sitosol ve interstisyel sıvıların termodinamik özelliklerini etkileyen kısıtlamalar uygular. Moleküler etkileşimler, reseptör-ligand sinyal kompleksleri, enzimler ve organeller serbestçe etkileşime girerler 9. Perisellüler ortam (yani interstitium) içindeki etkileşimler de kısıtlanır. Son kanıtlar, kalabalık çözeltilerde yüksek oranda inert makromoleküllerin perturb difüzyon, fiziksel ilişki, viskozite ve hidrodinamik özellikleri10olduğunu doğrulamaktadır.
İlginçtir, çeşitli popüler kalabalık ajanlar (yani, Ficoll, dextran, polivinylpyridone [PVP], ve sodyum 4-stirensülfonat [PSS]) farklı hücre tipleri ve farklı ortamlarda uygulandığında eşdeğer değildir. Bir önceki çalışmada, Ficoll PVP ile karşılaştırıldığında mezenkimal kök hücreler için daha az sitotoksik olduğu bildirilmiştir. Bu sonuçlar nötr yükü ve nispeten küçük hidrodinamik yarıçapı11sonucu olarak yorumlandı. Buna karşılık, ikinci bir çalışmada dextran ficoll12ile karşılaştırıldığında insan akciğer fibroblastları tarafından kollajen I birikimi uyarıcı daha etkili olduğunu bulundu . Kendi çalışmamızdan elde edilen veriler Ficoll hipertrofik skar kaynaklı fibroblastlar tarafından kollajen birikimini artırır düşündürmektedir, PVP bu hücreler için toksik ise13.
Bu kollajen için prokollajen dönüşüm ü vivo ortamda son derece kalabalık bir ortamda daha hızlı olduğu gösterilmiştir14, biyolojik reaksiyonların oranı seyreltilmiş 2-B kültür sisteminde gecikilir iken15. Biz burada in vitro protokolü optimize var, dermal fibroblastlar dermal fibrozis ve skar oluşumu için daha “in vivo gibi” bir model olarak hizmet veren ekimi göstermek için MMC içeren. Ortak 2-B kültür sisteminin aksine, MMC ile hHSFs yetiştirmek önemli ölçüde13kollajen biyosentez ve birikimi ni uyarır. Özellikle, fibrozis diğer özellikleri (yani, matris metalloproteinazların artan ekspresyonu [MDP] ve proinflamatuar sitokinler) ayrıca bu optimize MMC protokolü13altında belirgindir . Bu yöntemle ekili olduğunda, dermal hücrelerin in vivo ölçülen fizyolojik, biyokimyasal ve fonksiyonel parametreleri yeniden kapitalizettiği gösterilmiştir.
Optimize edilmiş MMC in vitro protokolü, hipertrofik skar dermisi ve ilgisiz komşu dermisten izole edilen dermal fibroblastlar tarafından kollajen ve diğer ECM proteinlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır. MMC ortamlarında in vitro olarak yetiştirildiğinde, HHSF’lerin dermal hipertrofik skar dokusuna benzer belirli özellikleri (yani mRNA, biyokimya, fizyoloji ve fenotip) ifade ettiği gözlenmiştir. Kanıtlar, crowders seçerken ve in vitro ekimi için MMC koşullarını optimize ederken fiziksel ve kimyasal özelliklerin önemli noktalar olduğunu göstermektedir.
Prensip kanıtı için, MMC protokolü burada Nitel ve nicel olarak Shikonin ve analoglarının apoptoza neden olma yeteneğini değerlendirmek için uygulanır. Bu dermal yara izi yönetmek için bu doğal kaynaklı Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) bileşiklerin potansiyel uygulamalarının değerlendirilmesi sağlar13. Buna rağmen, bu in vitro MMC protokolünün basitliği, maliyet etkinliği ve güncelliği, ab direktifi 2010/63/EU ve ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) tarafından memelilerde yapılan deneyleri ortadan kaldırmak için yapılan son düzenlemeleri de karşılar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, insan kutanöz skar dokusu için geliştirilmiş bir “scar-in-a-jar” in vitro modelini optimize etmeyi ve doğrulamasını amaçlamaktadır. Önceki çalışmalarda insan akciğer fibroblastları için MMC tekniğinin uygulama bildirilmiştir12, insan kemik iliği mezenkimal kök hücreler23, ve insan dermal fibroblastlar23 dekstran kullanarak12, Ficoll12, ve PVP23 c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Singapur Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı “SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research” ve “Tropics için Yara Bakımı İnovasyonu” IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 tarafından desteklendi. Yazarlar minnetle tavsiye ve Dr Paula Benny ve Dr Michael Raghunath yardım kabul.
Materials
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of “macromolecular crowding” in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
- Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture – A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).
