Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen
Summary
Generatie recombinantrotavirussen uit plasmid DNA is een essentieel instrument voor de studie van rotavirusreplicatie en pathogenese, en de ontwikkeling van rotavirusexpressievectoren en vaccins. Hierin beschrijven we een vereenvoudigde omgekeerde genetica benadering voor het genereren van recombinante rotavirussen, met inbegrip van stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten.
Abstract
Rotavirussen zijn een grote en evoluerende populatie van gesegmenteerde dubbelstrengs RNA-virussen die ernstige gastro-enteritis veroorzaken bij de jonge van vele zoogdier- en vogelsoorten, waaronder mensen. Met de recente komst van rotavirus omgekeerde genetica systemen, is het mogelijk geworden om gerichte mutagenese te gebruiken om rotavirus biologie te verkennen, te wijzigen en te optimaliseren bestaande rotavirus vaccins, en rotavirus multitarget vaccin vectoren te ontwikkelen. In dit rapport beschrijven we een vereenvoudigd reverse genetica systeem dat het mogelijk maakt de efficiënte en betrouwbare herstel van recombinante rotavirussen. Het systeem is gebaseerd op co-transfection van T7 transcriptie vectoren uitdrukken full-length rotavirus (+)RNAs en een CMV vector codering van een RNA capping enzym in BHK cellen constitutief produceren T7 RNA polymerase (BHK-T7). Recombinant rotavirussen worden versterkt door het overzien van de getransfecteerde BHK-T7 cellen met MA104 cellen, een aap niercel lijn die zeer tolerant is voor virusgroei. In dit rapport beschrijven we ook een aanpak voor het genereren van recombinante rotavirussen die een apart fluorescerend reporter-eiwit uitdrukken door de introductie van een 2A translationeel stop-herstartelement in genoomsegment 7 (NSP3). Deze aanpak voorkomt het verwijderen of wijzigen van een van de virale open leesframes, waardoor de productie van recombinante rotavirussen die volledig functionele virale eiwitten behouden terwijl het uitdrukken van een fluorescerend eiwit.
Introduction
Rotavirussen zijn belangrijke oorzaken van ernstige gastro-enteritis bij zuigelingen en jonge kinderen, evenals de jongen van vele andere zoogdier- en vogelsoorten1. Als leden van de Reoviridae familie hebben rotavirussen een gesegmenteerd dubbelstrengs RNA (dsRNA) genoom. De genoomsegmenten bevinden zich in een niet-gehulde icosahedralvirion gevormd uit drie concentrische lagen eiwit2. Op basis van sequencing en fylogenetische analyse van de genoomsegmenten zijn negen soorten rotavirus (A−D, F−J) gedefinieerd3. Deze stammen die rotavirussoort A omvatten, zijn verantwoordelijk voor de overgrote meerderheid van de menselijke ziekte4. De introductie van rotavirusvaccins in kindervaccinatieprogramma’s die in het laatste decennium beginnen, is gecorreleerd met een aanzienlijke vermindering van de mortaliteit en morbiditeit van het rotavirus. Het meest in het bijzonder is het aantal sterfgevallen door rotavirus gerelateerde sterfgevallen bij kinderen gedaald van ongeveer 528.000 in 2000 tot 128.500 in 20164,5. Rotavirus vaccins zijn geformuleerd uit levende verzwakte stammen van het virus, met 2 tot 3 doses toegediend aan kinderen door 6 maanden oud. Het grote aantal genetisch diverse rotavirusstammen die circuleren bij mensen en andere zoogdiersoorten, in combinatie met hun vermogen om snel te evolueren door middel van mutagenese en herassortiment, kan leiden tot antigene veranderingen in de soorten rotavirussen infecteren kinderen6,7,8. Dergelijke veranderingen kunnen de werkzaamheid van bestaande vaccins ondermijnen, waardoor ze moeten worden vervangen of gewijzigd.
De ontwikkeling van volledig plasmid-gebaseerde omgekeerde geneticasystemen die manipulatie van om het even welk van de 11 rotavirusgenoomsegmenten toelaten werd slechts onlangs bereikt9. Met de beschikbaarheid van deze systemen is het mogelijk geworden om moleculaire details van rotavirusreplicatie en pathogenese te ontrafelen, verbeterde screeningsmethoden met hoge doorvoer voor anti-rotavirusverbindingen te ontwikkelen en nieuwe potentieel effectievere klassen van rotavirusvaccins te creëren. Tijdens de replicatie van het rotavirus leiden afgetopte virale (+)RNA’s niet alleen de synthese van virale eiwitten, maar dienen ze ook als sjablonen voor de synthese van progeny dsRNA genoomsegmenten10,11. Alle rotavirus reverse genetica systemen beschreven tot op heden vertrouwen op de transfection van T7 transcriptie vectoren in zoogdier cellijnen als een bron van cDNA-afgeleide (+)RNAs gebruikt bij het herstellen van recombinant virussen9,12,13. Binnen de transcriptievectoren worden virale cDNO’s over de hele lengte geplaatst tussen een upstream T7-promotor en een downstream hepatitis deltavirus (HDV) ribozyme, zodat virale (+)RNA’s worden gesynthetiseerd door T7 RNA polymerase die authentieke 5′ en 3’termini (figuur 1A) bevatten. In de eerste generatie reverse genetica systeem, recombinante virussen werden gemaakt door transfecting baby hamster niercellen uitdrukken T7 RNA polymerase (BHK-T7) met 11 T7 (pT7) transcriptie vectoren, elke regiesynthese van een uniek (+)RNA van de simian SA11 virusstam, en drie CMV promoter-drive expression plasmiden, één die het aviaire reovirus p10FAST-fusie-eiwit codeert en twee coderingssubeenheden van het vacciniavirus D1R-D12L capping enzymcomplex9. Recombinant SA11 virussen gegenereerd in transfected BHK-T7 cellen werden versterkt door toezicht met MA104 cellen, een cellijn tolerant voor rotavirus groei. Een aangepaste versie van de eerste generatie reverse genetica systeem is beschreven dat niet langer gebruik maakt van steun plasmiden12. In plaats daarvan genereert het gewijzigde systeem met succes recombinante rotavirussen door bhk-T7-cellen te transfecteren met de 11 SA11 T7 transcriptievectoren, waarbij het voorbehoud is dat vectoren voor de virale fabriek (viroplasma) bouwstenen (niet-structurele eiwitten NSP2 en NSP5) worden toegevoegd op niveaus die 3 keer hoger liggen dan de andere vectoren14,15. Gewijzigde versies van het omgekeerde genetica systeem zijn ook ontwikkeld die het herstel van de menselijke KU en Odelia stammen van rotavirus16,17ondersteunen . Het rotavirus genoom is opmerkelijk vatbaar voor manipulatie door omgekeerde genetica, met recombinant virussen gegenereerd tot op heden met mutaties geïntroduceerd in VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, en NSP522,23. Onder de meest nuttige virussen die tot nu toe zijn gegenereerd, zijn die welke zijn ontworpen om fluorescerende reporter eiwitten (FPs)9,12,,21,24,25uit te drukken .
In deze publicatie bieden we het protocol voor het omgekeerde geneticasysteem dat we in ons laboratorium gebruiken om recombinante stammen van SA11 rotavirus te genereren. Het belangrijkste kenmerk van ons protocol is co-transfection van BHK-T7 cellen met de 11 pT7 transcriptie vectoren (gewijzigd om 3x niveaus van de pT7/NSP2SA11 en pT7/NSP5SA11 vectoren) en een CMV expressie vector codering van de Afrikaanse varkenspest virus (ASFV) NP868R capping enzym21 (Figuur 2). In onze handen leidt de aanwezigheid van de NP868R plasmid tot de productie van hogere titers van recombinante virussen door getransfecteerde BHK-T7 cellen. In deze publicatie bieden we ook een protocol voor het wijzigen van de pT7/NSP3SA11 plasmide zodanig dat recombinante virussen kunnen worden gegenereerd die niet alleen het segment 7 eiwitproduct NSP3 uitdrukken, maar ook een aparte FP. Dit wordt bereikt door het Open Leeskader (ORF) van NSP3 in het pT7/NSP3SA11 plasmide opnieuw te ontwerpen en een downstream 2A translationeel stop-restart-element te bevatten, gevolgd door een FP ORF (Figuur 1B)24,26. Door deze aanpak hebben we recombinante rotavirussen gegenereerd die verschillende FP’s uitdrukken: UnaG (groen), mKate (verrood), mRuby (rood), TagBFP (blauw), GVB (cyaan) en YFP (geel)24,27,28. Deze FP-expressing rotavirussen worden gemaakt zonder de NSP3 ORF te verwijderen, waardoor virussen worden opgedaan die naar verwachting een volledige aanvulling van functionerende virale eiwitten zullen coderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In ons laboratorium vertrouwen we routinematig op het omgekeerde geneticaprotocol dat hierin wordt beschreven om recombinante SA11-rotavirussen te produceren. Met deze aanpak, individuen met weinig ervaring in moleculaire biologie technieken of het werken met rotavirussen herstellen recombinant virussen, zelfs op hun eerste poging. We hebben bijna 100 recombinante virussen gegenereerd volgens dit protocol, inclusief die met genomen die zijn opnieuw ontworpen om vreemde eiwitten (bijvoorbeeld FP’s) uit te drukken en die s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies R03 AI131072 en R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, en de Lawrence M. Blatt Endowment. Wij danken de leden van het IU Rotahoosier laboratorium, Ulrich Desselberger, en Guido Papa voor hun vele bijdragen en suggesties in de ontwikkeling van de omgekeerde genetica protocol.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
