리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 회수하는 역유전학 방법 간소화
Summary
플라스미드 DNA로부터의 재조합 로타바이러스 생성은 로타바이러스 복제 및 병인, 및 로타바이러스 발현 벡터 및 백신의 개발을 위한 필수적인 도구를 제공한다. 본 명세서에서, 우리는 형광 리포터 단백질을 발현하는 균주를 포함하는 재조합 로타바이러스를 생성하기 위한 단순화된 역유전학 접근법을 설명한다.
Abstract
Rotaviruses는 인간을 포함하여 많은 포유류 및 조류 호스트 종의 젊은에 있는 가혹한 위장염을 일으키는 원인이 되는 분할된 이중 좌초된 RNA 바이러스의 크고 진화하는 인구입니다. 로타바이러스 역유전학 시스템의 최근 출현으로, 로타바이러스 생물학을 탐구하고, 기존 로타바이러스 백신을 수정 및 최적화하고, 로타바이러스 다표적 백신 벡터를 개발하기 위해 지시된 돌연변이 발생을 사용할 수 있게 되었다. 이 보고서에서는 재조합 로타바이러스의 효율적이고 신뢰할 수 있는 복구를 허용하는 단순화된 역유전학 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 전신 로타바이러스(+)RNAs를 발현하는 T7 전사 벡터의 공동 형질감염과 BHK 세포에 RNA 캡핑 효소를 코딩하는 CMV 벡터를 구성하여 T7 RNA 폴리머라제(BHK-T7)를 생성한다. 재조합 로타바이러스는 바이러스 성장을 위해 매우 허용되는 원숭이 신장 세포주인 MA104 세포로 형질감염된 BHK-T7 세포를 감독함으로써 증폭된다. 본 보고서에서, 우리는 또한 게놈 세그먼트 7(NSP3)으로 2A 번역 정지 재시작 원소의 도입을 통해 별도의 형광 리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 생성하기 위한 접근법을 설명한다. 이 접근법은 바이러스 성 개방 판독 프레임 중 어느 것을 삭제하거나 수정하는 것을 방지하여 형광 단백질을 발현하면서 완전한 기능의 바이러스 성 단백질을 유지하는 재조합 로타바이러스의 생산을 허용합니다.
Introduction
로타 바이러스는 유아와 어린 아이들에 있는 가혹한 위장염의 중요한 원인, 뿐만 아니라 많은 그밖 포유류 및 조류 종의 젊은1. Reoviridae 가족의 일원으로서, 로타바이러스는 분할된 이중 가닥 RNA (dsRNA) 게놈이 있습니다. 게놈 세그먼트는 단백질2의3개의 동심 층에서 형성된 비 봉투에 싸인 icosahedral virion 안에 포함됩니다. 게놈 세그먼트의 시퀀싱 및 계통유전학 적 분석에 기초하여, 9종의 로타바이러스(A−D, F−J)가3가지로정의되었다. 로타바이러스 종 A를 포함하는 이들 균주는 대부분의 인간 질환에 대한 책임이 있다4. 지난 10 년 에서 시작 된 어린 시절 예방 접종 프로그램에 로타 바이러스 백신의 도입은 로타 바이러스 사망률과 이환율의 상당한 감소와 상관 관계가 있습니다. 가장 주목할 만한, 로타 바이러스 관련 어린 시절 죽음의 수는 2000년에 대략 528,000에서 2016년에 128,500에4,,5로감소했습니다. 로타바이러스 백신은 생후 6개월까지 어린이에게 2~3회 투여되는 살아있는 감쇠 균주에서 제조됩니다. 인간 과 다른 포유류 종에서 순환하는 유전적으로 다양한 로타 바이러스 균주의 많은 수, 돌연변이 발생 및 재분류를 통해 빠르게 진화하는 능력과 결합, 어린이를 감염로 타 바이러스의 유형에 항원 변화를 초래할 수있다6,,7,,8. 이러한 변화는 기존 백신의 효능을 약화시킬 수 있으며, 대체 또는 수정이 필요합니다.
11개의 로타바이러스 게놈 세그먼트 중 어느 한 쪽의 조작을 가능하게 하는 완전 플라스미드 기반 역유전학 시스템의 개발은 최근에9개달성되었다. 이러한 시스템의 가용성으로, 그것은 로타 바이러스 복제 및 병인의 분자 세부 사항을 해명 할 수있게되었다, 안티 로타 바이러스 화합물에 대한 개선 된 높은 처리량 스크리닝 방법을 개발하고, 로타 바이러스 백신의 새로운 잠재적으로 더 효과적인 클래스를 만들 수 있게되었다. 로타바이러스 복제 동안, 바이러스 성 (+)RNAs는 바이러스 성 단백질의 합성을 안내 할뿐만 아니라 자손 dsRNA 게놈 세그먼트10,,11의합성을위한 템플릿역할을합니다. 현재까지 기술된 모든 로타바이러스 역유전학 시스템은 재조합 바이러스9,,12,,13을회수하는데 사용되는 cDNA 유래(+)RNA의 공급원으로서 포유류 세포주내로 T7 전사 벡터의 형질감염에 의존한다. 전사 벡터 내에서, 전신 바이러스 성 cDNA는 상류 T7 프로모터와 다운스트림 간염 델타 바이러스 (HDV) ribozyme 사이에 위치되어 바이러스 (+)RNA가 본격적인 5’및 3’termini를 포함하는 T7 RNA 폴리머라제에 의해 합성됩니다(그림 1A). 1세대 역유전학 시스템에서, 재조합 바이러스는 11T7(pT7) 전사 벡터로 T7 RNA 폴리머라제(BHK-T7)를 발현하는 아기 햄스터 신장 세포를 트랜스펙팅함으로써 만들어졌으며, 시미안 SA11 바이러스 균주의 독특한(+)RNA및 3개의 CMV 프로모터-구동 발현 플라스미드의 각각의 지시 합성, 조류 류바이러스 p10FAST 융합 단백질을 인코딩한 1개 및 백시니아 바이러스 D1R-D12L 캡핑 효소 복합체의 2개의 인코딩서브유닛. 형질감염된 BHK-T7 세포에서 생성된 재조합 SA11 바이러스는 로타바이러스 성장을 허용하는 세포주인 MA104 세포를 감독함으로써 증폭되었다. 1세대 역유전학 시스템의 변형된 버전은 더 이상 지지플라스미드(12)를사용하지 않는다고 기술되었다. 대신, 수정된 시스템은 단순히 BHK-T7 세포를 11개의 SA11 T7 전사 벡터로 트랜스펙팅함으로써 재조합 로타바이러스를 성공적으로 생성하며, 바이러스 성 공장(viroplasm) 빌딩 블록(비구조적 단백질 NSP2 및 NSP5)에 대한 벡터가 다른 벡터14, 15보다,153배 높은 수준으로 추가된다는 경고와 함께. 역유전학 시스템의 변형된 버전은 또한 로타바이러스16,,17의인간 KU 및 Odelia 균주의 회복을 지원하는 개발되었다. 로타바이러스 게놈은 VP418,NSP19,NSP219,NSP320,,21,NSP522,,23에도입된 돌연변이와 함께 현재까지 생성된 재조합 바이러스와 함께 역유전학에 의한 조작이 현저하게 가능하다. 지금까지 생성된 가장 유용한 바이러스 중에는 형광 리포터 단백질(FPs)9,,12,,21,,24,,25를발현하도록 설계된 바이러스가 있다.
이 간행물에서는, 우리는 우리가 SA11 로타바이러스의 재조합 긴장을 생성하기 위하여 우리의 실험실에서 사용하는 역유전학 시스템을 위한 프로토콜을 제공합니다. 당사의 프로토콜의 주요 특징은 11개의 pT7 전사 벡터(pT7/NSP2SA11 및 pT7/NSP5SA1 벡터의 3배 수준을 포함하도록 변형된 변형)와 아프리카 돼지 열바이러스(ASFV) NP868R 캡핑 효소를 코딩하는 CMV 발현 벡터를 가진 BHK-T7 세포의 병용화이다.21 Figure 2 우리의 손에, NP868R 플라스미드의 존재는 형질감염된 BHK-T7 세포에 의한 재조합 바이러스의 더 높은 역가의 생산으로 이어집니다. 본 공보에서는, 우리는 또한 세그먼트 7 단백질 생성물 NSP3뿐만 아니라 별도의 FP를 발현하는 재조합 바이러스가 생성될 수 있도록 pT7/NSP3SA11 플라스미드를 수정하기 위한 프로토콜을 제공한다. 이는 fp ORF(도1B)24,,26에이어 다운스트림 2A 번역 정지-재시작 엘리먼트를 포함하는 pT7/NSP3SA11 플라스미드에서 NSP3 오픈 판독 프레임(ORF)을 재엔지니어링함으로써 달성된다. 이러한 접근법을 통해, 우리는 다양한 FPs를 발현하는 재조합 로타바이러스를 생성하였다: UnaG (녹색), mKate (원빨색), mRuby (빨강), TagBFP (청색), CFP (시안), 및 YFP (노란색)24,,27,,28. 이러한 FP 발현 로타바이러스는 NSP3 ORF를 삭제하지 않고 만들어지므로 기능하는 바이러스 단백질의 완전한 보완을 인코딩할 것으로 예상되는 바이러스를 산출합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 실험실에서, 우리는 재조합 SA11 로타바이러스를 생성하기 위하여 본원에 기술된 역유전학 프로토콜에 일상적으로 의존한다. 이 접근으로, 분자 생물학 기술에 있는 작은 경험이 있는 개별 또는 rotaviruses로 일하는 것은 그들의 첫번째 시도조차 재조합 바이러스를 복구합니다. 우리는 이 프로토콜에 따라 거의 100개의 재조합 바이러스를 생성했는데, 여기에는 외래 단백질(예를 들어, FPs)을 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 R03 AI131072 및 R21 AI144881, 인디애나 대학 창업 자금, 로렌스 M. 블랫 인다우먼트에 의해 지원되었다. 우리는 IU 로타후시에 실험실의 구성원, 울리히 Desselberger, 및 귀도 파파 역 유전학 프로토콜을 개발에 그들의 많은 기여와 제안에 감사드립니다.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
