Упрощенный обратный метод генетики для восстановления рекомбинантных ротавирусов Экспрессинг Репортер белки
Summary
Генерация рекомбинантных ротавирусов из плазмидной ДНК является важным инструментом для изучения ротавирусной репликации и патогенеза, а также развития переносчиков и вакцин с использованием ротавирусного экспрессии. В этом мы описываем упрощенный обратный подход к генетике для генерации рекомбинантных ротавирусов, включая штаммы, выражающие флуоресцентные белки репортера.
Abstract
Ротавирусы представляют собой большую и развивающуюся популяцию сегментированных двухцепочечных РНК-вирусов, вызывающих тяжелый гастроэнтерит у молодых многих видов млекопитающих и птиц, включая людей. С недавним появлением ротавирусной системы обратной генетики стало возможным использовать направленный мутагенез для изучения ротавирусной биологии, модификации и оптимизации существующих ротавирусных вакцин и разработки переносчиков ротавирусной многоцелевой вакцины. В этом отчете мы описываем упрощенную систему обратной генетики, которая позволяет эффективно и надежно восстановить рекомбинантные ротавирусы. Система основана на сотрансфокации векторов транскрипции T7, выражающих полноформатный ротавирус (КВ) РНК и вектор CMV, кодирующий фермент РНК в клетки BHK, образующие т7 РНК-полимеразы (BHK-T7). Рекомбинантные ротавирусы усиливаются, контролируя трансинфицированные клетки BHK-T7 с ma104 клетками, линией клеток почек обезьяны, которая является весьма вседозволенной для роста вируса. В этом отчете мы также описываем подход к генерации рекомбинантных ротавирусов, которые выражают отдельный флуоресцентный белок репортера путем введения 2A переводного элемента стоп-перезагрузки в сегмент генома 7 (NSP3). Такой подход позволяет избежать удаляния или модификации любого из вирусных открытых кадров для чтения, что позволяет выпускать рекомбинантные ротавирусы, которые сохраняют полностью функциональные вирусные белки, выражая флуоресцентный белок.
Introduction
Ротавирусы являются основными причинами тяжелого гастроэнтерита у младенцев и маленьких детей, а также молодых многих других млекопитающих и птиц видов1. Как члены семейства Reoviridae, ротавирусы имеют сегментированный двухцепочечный геном РНК (dsRNA). Сегменты генома содержатся в неописуемом икосахедря, образованном из трех концентрических слоев белка2. На основе секвенирования и филогенетического анализа сегментов генома было определено девять видов ротавируса (A’D, F-J)3. Эти штаммы, включающие ротавирусного вида А, ответственны за подавляющее большинство болезней человека4. Внедрение ротавирусных вакцин в программы иммунизации детей, начиная с последнего десятилетия, коррелирует со значительным снижением смертности и заболеваемости ротавирусом. Примечательно, что число случаев смерти детей, связанных с ротавирусом, сократилось с примерно 528 000 в 2000 году до 128 500 в 2016 году4,,5. Ротавирусные вакцины формулируются из живых ослабленных штаммов вируса, при этом детям к 6 месяцам вводят от 2 до 3 доз. Большое количество генетически разнообразных штаммов ротавируса, циркулирующих в людях и других видах млекопитающих, в сочетании с их способностью быстро развиваться через мутагенез и реассортизу, может привести к антигенным изменениям в типах ротавирусов, заражающих детей6,,7,8. Такие изменения могут подорвать эффективность существующих вакцин, что требует их замены или модификации.
Разработка полностью плазмедных систем обратной генетики, позволяющих манипулировать любым из 11 сегментов ротавирусного генома, только недавно была достигнута9. С наличием этих систем стало возможным разгадать молекулярные детали репликации ротавируса и патогенеза, разработать усовершенствованные методы скрининга высокой пропускной записи на антиротавирусные соединения и создать новые потенциально более эффективные классы ротавирусных вакцин. Во время репликации ротавируса, ограниченные вирусные (К) РНК не только направляют синтез вирусных белков, но и служат шаблонами для синтеза потомства сегментов генома dsRNA10,11. Все ротавирусные системы обратной генетики, описанные на сегодняшний день, полагаются на трансфекцию переносчиков транскрипции T7 в клеточные линии млекопитающих в качестве источника кДНК-производных (Я)РНК, используемых в восстановлении рекомбинантных вирусов9,12,13. В транскрипции векторов, полнометражные вирусные cDNAs расположены между вверх по течению T7 промоутер и вниз по течению вируса дельты гепатита (HDV) ribozyme таким образом, что вирусные (К) РНК синтезируются T7 РНК полимеразы, которые содержат подлинные 5′ и 3′-терминини (Рисунок 1A). В системе обратной генетики первого поколения рекомбинантные вирусы были сделаны путем трансфектирования клеток почек хомяка, выражающего полимеразу T7 РНК (BHK-T7) с 11 векторами транскрипции T7 (pT7), каждый направляющий синтез уникального (к) РНК штамма вируса SA11, и три CMV промоутер-драйв выражение плазмиды, один кодирования птичьего реовируса p10FAST синтеза белка и два encoding подразделения вируса вакцины D1R-D12L capping комплекс9. Рекомбинантные вирусы SA11, генерируемые в трансинфицированных клетках BHK-T7, были усилены путем наблюдения с помощью MA104 клеток, клеточной линии, разрешительной для роста ротавируса. Измененная версия системы обратной генетики первого поколения была описана, что больше не использует поддержку плазмиды12. Вместо этого, модифицированная система успешно генерирует рекомбинантные ротавирусы просто путем трансфектации BHK-T7 клеток с 11 SA11 T7 транскрипции векторов, с оговоркой, что векторы для вирусной фабрики (viroplasm) строительные блоки (неструктурные белки NSP2 и NSP5) добавляются на уровнях 3 раза выше, чем другие векторы14.15 Также разработаны модифицированные версии системы обратной генетики, которые поддерживают восстановление штаммов ротавируса16,,17. Геном ротавируса удивительно поддается манипуляции обратной генетики, с рекомбинантными вирусами, генерируемыми на сегодняшний день с мутациями, введенными в VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, и NSP522,23. Среди наиболее полезных вирусов, генерируемых до сих пор являются те, которые были разработаны, чтобы выразить флуоресцентные белки репортера (FPs)9,12,21,24,25.
В этой публикации мы предоставляем протокол для обратной генетической системы, которую мы используем в нашей лаборатории для генерации рекомбинантных штаммов ротавируса SA11. Ключевой особенностью нашего протокола является совместное перевод конторы клеток BHK-T7 с 11 переносчиками транскрипции pT7 (модифицированные, чтобы включить 3x уровни pT7/NSP2SA11 и pT7/NSP5SA11 векторов) иFigure 2вектор экспрессии CMV, кодирующий африканский свиной вирус (ASFV) NP868R.21 В наших руках наличие плазмиды NP868R приводит к выработке более высоких титрах рекомбинантных вирусов трансфицировоками БХК-Т7. В этой публикации мы также предоставляем протокол для изменения плазмида pT7/NSP3SA11 таким образом, что могут быть созданы рекомбинантные вирусы, которые выражают не только белок сегмента 7 NSP3, но и отдельный FP. Это достигается путем реинжиниринга NSP3 открытого чтения кадра (ORF) в pT7/NSP3SA11 плазмид содержать вниз по течению 2A переводный стоп-перезагрузки элемент следуют FP ORF (Рисунок 1B)24,26. Благодаря этому подходу, мы создали рекомбинантные ротавирусы, выражающие различные FPs: UnaG (зеленый), mKate (далеко-красный), mRuby (красный), TagBFP (синий), CFP (циан), и YFP (желтый)24,27,28. Эти FP-выражения ротавирусов производятся без удаляя NSP3 ORF, таким образом, что дает вирусы, которые, как ожидается, кодируют полный комплект функционирующих вирусных белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
В нашей лаборатории мы обычно полагаемся на описанный здесь протокол обратной генетики для производства рекомбинантных ротавирусов SA11. При таком подходе люди с небольшим опытом работы в методах молекулярной биологии или работающие с ротавирусами восстанавливают рекомбинантные виру…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH гранты R03 AI131072 и R21 AI144881, Индиана университета Start-Up Финансирования, и Лоуренс М. Блатт фонда. Мы благодарим членов лаборатории IU Rotahoosier, Ульриха Дессельбергера и Гвидо Папа за их многочисленный вклад и предложения в разработке обратного протокола генетики.
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- . Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019)
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
