实验自身免疫性脑脊髓炎中枢神经系统淋巴细胞渗透的流量细胞计量分析
Summary
本手稿提供了在小鼠中诱导活性实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 的协议。还提出了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中渗透淋巴细胞的方法，以表明淋巴细胞如何参与中枢自身免疫性疾病的发展。
Abstract
多发性硬化症（MS）是由环境因素和易感遗传背景共同作用的中枢神经系统（CNS）的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是MS的典型疾病模型，广泛用于研究T淋巴细胞特异性骨髓抗原在中枢素引起炎症反应的发病机制。评估中枢子中的淋巴细胞如何调节疾病的发展是非常重要的。然而，由于难以从大脑中隔离和检测渗透淋巴细胞，测量中枢机中渗透淋巴细胞的数量和质量的方法非常有限。本手稿提供了一个协议，用于从 CNS 中分离、识别和表征渗透淋巴细胞，有助于我们了解淋巴细胞如何参与中枢自免疫性疾病的发展。
Introduction
作为一种慢性脱髓性疾病，MS影响全球约250万人，缺乏治疗1。它也被认为是一种自身免疫性疾病，其中明蛋白抗原特异性T淋巴细胞引发炎症反应，导致在CNS2中脱叶和结子损伤。实验自身免疫性脑脊髓炎（EAE）作为CNS 3中典型的自身免疫性脱毛病模型，已被广泛用于研究MS的致病机制。有两种方法可以诱导EE：一种是积极诱导EE，通过免疫动物的脑素成分，另一种是采用转移，通过转移脑原T细胞到受体2，4，5。,4,5对EAE的感知性在不同的动物菌株6中是不同的。在C57BL/6小鼠中，霉素奥利戈登德细胞蛋白（MOG）35~55挑战诱导一种单相疾病，在CNS中具有广泛的脱霉和炎症，该病在基因靶向小鼠7的实验中经常使用。
生成脑电图特异性活性T细胞是EE疾病的发生和发展所需的，是EE和MS的免疫学标志。当MOG 35-55 Ag遇到时，这些T淋巴细胞诱导炎症和诱导效应细胞进入中枢，导致去叶化和轴翁破坏88，99。在EAE模型中，有充分证据表明神经抗原特异性CD4+T细胞可以启动和维持神经炎和病理学3,3，10。根据主要细胞因子的产生，CD4+ T淋巴细胞被分为不同的子集：Th1（以产生干扰素-γ）、Th2（以白细胞间4的产生为特征）和Th17（以白细胞间17的产生为特征）。据认为，Th1和Th17细胞的激活有助于诱导，维持和调节炎症消炎在EAE和MS通过分泌效应细胞因子 IFN-γ和IL-17，这能够激活巨噬细胞和招募嗜中性粒细胞到炎症部位加速病变11。
由于自反应T细胞将BBB穿过到中枢，诱导MS和EE的疾病发展，因此分析CMS中的T细胞非常重要。然而，很少有既定的协议，从中枢12分离淋巴细胞。因此，开发了一种优化的方法，用于从大脑中隔离单核细胞，用标记CD45、CD11b、CD3、CD4、INF-g和IL-17分析T淋巴细胞，用于流细胞学。该方法使用MOG35~55辅助结核分 枝杆 菌H37 Ra和百日咳毒素工作溶液（PTX）在小鼠中诱导EE的主动免疫模型。然后，采用机械分离和密度梯度离心方法分离CNS单核细胞。最后，通过染色多个标记来识别大脑中的T淋巴细胞和子集，优化了流式细胞测量门控策略。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究提出了在C57BL/6小鼠中使用MOG35-55诱导和监测EE的方案，该模型被认为是MS的典型神经免疫实验动物模型。 EAE可以根据研究的目的，诱导改变小鼠的菌株或用于诱导的蛋白质类型。例如，在SJL小鼠中使用PLP139~151肽可以诱发复发-复发的EE疾病过程，这特别适合评估复发15的治疗效果。此处概述的实验程序也可以应用于其他 EAE 协议7。在此模型中，C57BL/6小鼠接?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了国家自然科学基金资助（31570921至ZJ，81571533至LS），上海市卫生委和计划生育委员会（201540206至ZJ），瑞金医院北研究资助（2017ZX01至ZJ）。
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
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