Analyse cytométrique du flux de l’infiltration de lymphocytes dans le système nerveux central pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale
Summary
Ce manuscrit présente un protocole pour induire l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale active (EAE) chez les souris. Une méthode pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes infiltrés dans le système nerveux central (SNC) est également présentée pour montrer comment les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune de CNS.
Abstract
La sclérose en plaques (SP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) causée par la combinaison de facteurs environnementaux et de milieux génétiques sensibles. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle typique de la maladie de MS largement utilisé pour étudier la pathogénie dans laquelle les lymphocytes T spécifiques aux antigènes de myéline initient une réaction inflammatoire dans le SNC. Il est très important d’évaluer comment les lymphocytes du SNC régulent le développement de la maladie. Cependant, l’approche pour mesurer la quantité et la qualité des lymphocytes infiltrés dans le SNC est très limitée en raison des difficultés à isoler et à détecter les lymphocytes infiltrés du cerveau. Ce manuscrit présente un protocole qui est utile pour l’isolement, l’identification, et la caractérisation des lymphocytes infiltrés du SNC et sera utile pour notre compréhension de la façon dont les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune du SNC.
Introduction
En tant que maladie de démyélinisation chronique du SNC, la SP touche environ 2,5 millions de personnes dans le monde et manque de traitements curatifs1. Il est également considéré comme une maladie auto-immune, dans laquelle les lymphocytes T spécifiques à l’antigène myélin initient une réaction inflammatoire et conduisent à la démyélinisation et aux lésions axonales dans le SNC2. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) a été largement utilisée pour étudier les mécanismes pathogènes de la SP comme modèle classique de maladie auto-immune de la maladie de démyélinisation dans le SNC3. Il existe deux façons d’induire EAE: l’une est d’induire EAE activement en immunisant les animaux avec des composants de myéline, un autre est le transfert d’adoption en transférant les lymphocytes T encéphalitogènes dans le récepteur2,4,5. Les susceptibilités à l’EAE sont différentes dans différentes souches animales6. Chez les souris C57BL/6, le défi de la glycoprotéine de l’oligodendrocyte de myéline (MOG) 35–55 induit une maladie monophasique avec une démyélinisation et une inflammation étendues dans le SNC, qui est fréquemment utilisé dans des expériences avec des sourisgéniquesciblées 7 .
La génération de lymphocytes T réactifs spécifiques à la myéline est nécessaire pour l’apparition et le développement de la maladie dans l’EAE et est un signe immunologique de l’EAE et de la SP. Les lymphocytes T autoréactifs activés traversent la barrière hémato-encéphalique (BBB) dans le SNC sain et initient la maladie d’EAE. Lorsque MOG 35–55 Ag est rencontré, ces lymphocytes T induisent l’inflammation et le recrutement de cellules effecteurs dans le SNC, ce qui entraîne la démyélinisation et la destruction de l’axone8,9. Dans le modèle EAE, il existe de nombreuses preuves que les cellules CD4+ T spécifiques aux neuroantigènes peuvent initier et soutenir la neuroinflammation et la pathologie3,10. Selon les principales cytokines produites, les lymphocytes CD4+ T ont été classés en différents sous-ensembles : Th1 (caractérisé par la production d’interféron-γ), Th2 (caractérisé par la production d’interleukine 4) et Th17 (caractérisé par la production d’interleukine 17). On croit que l’activation des cellules Th1 et Th17 contribuent à l’induction, l’entretien et la régulation de la démyélinisation inflammatoire dans EAE et sp en sécrétant les cytokines effecteurs IFN-γ et IL-17, qui sont capables d’activer les macrophages et de recruter des neutrophiles aux sites inflammatoires pour accélérer les lésions11.
Étant donné que les lymphocytes T autoréactifs traversent le BBB dans le SNC et induisent le développement de maladies dans la SP et l’EAE, il est très important d’analyser les lymphocytes T dans le SNC. Cependant, il existe très peu de protocoles établis pour l’isolement des lymphocytes du SNC12. Par conséquent, une méthode optimisée pour isoler les cellules mononucléaires du cerveau et analyser les lymphocytes T avec des marqueurs CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g et IL-17 pour la cytométrie de flux a été développée. La méthode utilise MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra and Pertussis Toxine Working Solution (PTX) pour induire un modèle de vaccination active de l’EAE chez les souris. Ensuite, des méthodes mécaniques de centrifugation de gradient de séparation et de densité sont utilisées pour l’isolement des cellules mononucléaires du SNC. Enfin, une stratégie optimisée de gating de cytométrie de flux est employée pour identifier les lymphocytes T et les sous-ensembles du cerveau en tachant plusieurs marqueurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude présente un protocole pour induire et surveiller l’EAE à l’aide de MOG35-55 chez les souris C57BL/6, qui sont considérées comme un modèle animal expérimental neuroimmunologique typique de la SP. EAE peut être induit variant les souches de souris ou le type de protéine utilisé pour l’induction selon le but de l’étude. Par exemple, l’utilisation du peptide PLP139–151 chez les souris SJL peut induire un cours de la maladie eae qui est particulièrement bien adapté pour évaluer les effets…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par la subvention de la National Natural Science Foundation of China (31570921 à ZJ, 81571533 à LS), la Commission municipale de la santé de Shanghai et la planification familiale (201540206 à ZJ), la subvention de recherche de l’hôpital Ruijin Nord (2017ZX01 à ZJ).
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
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