実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析
Summary
本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。
Abstract
多発性硬化症(MS)は、環境要因と遺伝的背景の影響を受けやすい遺伝的背景の組み合わせによって引き起こされる中枢神経系(CNS)の自己免疫疾患である。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、ミエリン抗原に特異的なTリンパ球がCNSで炎症反応を起こさせる病因を調べたりするために広く使用されているMSの典型的な疾患モデルである。CNSのリンパ球が疾患の発症をどのように調節しているかを評価することは非常に重要です。しかし、脳から浸潤したリンパ球の分離と検出が困難なため、CNS内の浸潤リンパ球の量と質を測定するアプローチは非常に限られています。この原稿は、CNSからの浸潤リンパ球の単離、同定、および特徴付けに有用であり、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを理解するのに役立つプロトコルを提示する。
Introduction
CNSの慢性脱髄疾患として、MSは世界中で約250万人に影響を及ぼし、治癒的治療を欠いている1.また、自己免疫疾患と考えられ、その中でミエリン抗原特異的Tリンパ球が炎症反応を起こし、CNS2において脱髄および軸索損傷を引き起こす。2実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、CNS3における古典的な自己免疫脱髄疾患モデルとしてMSの病原性メカニズムを調査するために広く使用されてきた3。EAEを誘導する方法は2つあり、1つはミエリン成分で動物を免疫することによってEAEを積極的に誘導し、もう1つは脳原性T細胞を受容体22、4、54,5に移すことによって養子転移することである。EAEへの感受性は、異なる動物株6で異なっている。C57BL/6マウスにおいて、ミエリンオリゴデンドロキ酸糖タンパク質(MOG)35~55チャレンジは、CNSにおける広範な脱髄および炎症を伴う単相性疾患を誘発し、遺伝子標的マウスの実験で頻繁に使用される7。
ミエリン特異的反応性T細胞の生成は、EAEにおける疾患の発生および発症に必要であり、EAEおよびMS.活性化自己反応性Tリンパ球が血液脳関門(BBB)を健康なCNSに横断し、EAE疾患を開始する免疫学的徴候である。MOG 35-55 Agが発生すると、これらのTリンパ球は炎症を誘発し、CNSにエフェクター細胞を動員し、脱髄および軸索破壊88,99を生じる。EAEモデルでは、神経抗原特異的CD4+T細胞が神経炎症および病理3,3,10を開始し、持続することができるという十分な証拠がある。産生される主要なサイトカインに応じて、CD4+Tリンパ球は異なるサブセットに分類されている:Th1(インターフェロンγの産生によって特徴付けられる)、Th2(インターロイキン4の産生によって特徴付けられる)、およびTh17(インターロイキン17の産生によって特徴付けられる)。Th1およびTh17細胞の活性化は、マクロファージを活性化し、病変を加速させるために炎症性部位に好中球を求めることができるエフェクターサイトカインIFN-γおよびIL-17を分泌することにより、EAEおよびMSにおける炎症性脱髄の誘導、維持、および調節に寄与すると考えられている。
自己反応性T細胞は、CNSにBBBを横断し、MSおよびEAEにおける疾患の発症を誘導するので、CNS内のT細胞を分析することは非常に重要である。しかし、CNS12からリンパ球を単離するための確立されたプロトコルはほとんどありません。そこで、単核細胞を脳から単離し、Cd45、CD11b、CD3、CD4、INF-g、およびIL-17のフローサイトメトリーを用いてTリンパ球を解析するための最適化された方法を開発した。この方法では、MOG35-55アジュバント結核 菌 H37 Raおよびペルタシス毒素ワーキングソリューション(PTX)を用いて、マウスにおけるEAEの活性免疫モデルを誘導する。そして、CNS単核細胞の単一核細胞の単離に機械的分離及び密度勾配遠心分離法が用いられる。最後に、最適化されたフローサイトメトリー測定の測定戦略を使用して、複数のマーカーを染色することによって脳からTリンパ球およびサブセットを同定する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究は、C57BL/6マウスにおけるMOG35-55を用いてEAEを誘導および監視するプロトコルを提示し、これはMS.EAEの典型的な神経免疫学的実験動物モデルと考えられる。例えば、SJLマウスでPLP139-151ペプチドを使用すると、再発症15に対する治療効果の評価に特に適した再発性EAE疾患コースを誘発し得る。ここで概説する実験手順は、他のEAEプロトコル7にも適用でき…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団助成金(31570921からZJ、81571533からLS)、上海市保健家族計画委員会(201540206からZJ)、瑞津病院ノース研究助成金(2017ZX01からZJ)によって支援されました。
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
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