실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석
Summary
이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.
Abstract
다발성 경화증 (MS)은 환경 적 요인과 취약한 유전 배경의 조합으로 인한 중추 신경계 (CNS)의 자가 면역 질환입니다. 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은 MYelin 항원특이적 T 림프구가 CNS에서 염증 반응을 개시하는 병원발생을 조사하는 데 널리 사용되는 MS의 전형적인 질병 모델이다. CNS의 림프구가 질병의 발달을 어떻게 조절하는지 평가하는 것이 매우 중요합니다. 그러나, CNS에서 침투된 림프구의 양과 품질을 측정하는 접근법은 뇌에서 침투된 림프구를 분리하고 검출하는 데 어려움이 있기 때문에 매우 제한적이다. 이 원고는 CNS에서 침투된 림프구의 격리, 식별 및 특성화에 유용하며 림프구가 CNS 자가 면역 질환의 개발에 어떻게 관여하는지에 대한 우리의 이해에 도움이 될 것입니다.
Introduction
CNS의 만성 탈근질환으로서 MS는 전 세계적으로 약 250만 명에게 영향을 미치고 치료 치료1이부족하다. 또한 골수린 항원 특이적 T 림프구가 염증 반응을 시작하고 CNS2에서탈량 및 축산 손상을 유도하는 자가 면역 질환으로 간주됩니다. 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은 CNS3에서고전적인 자가면역 탈생 질환 모델로서 MS의 병원성 메커니즘을 조사하는 데 널리 사용되고 있다. EAE를 유도하는 방법에는 두 가지가 있습니다: 하나는 골린 성분으로 동물을 예방 접종함으로써 EAE를 적극적으로 유도하는 것입니다, 또 다른 하나는 뇌성 T 세포를 수용체2,,4,,5로이송하여 입양 전달이다. EAE에 대한 감수성은 다른 동물 균주6에서다릅니다. C57BL/6 마우스에서, myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) 35-55 도전은 유전자 표적 마우스를 가진 실험에서 빈번하게 이용되는 CNS에 있는 광대한 탈근 및 염증을 가진 단면질환을 유도합니다7.
골린 특이적 반응성 T 세포의 생성은 EAE에서 질병의 발생 및 발달에 필요하며 EAE와 MS. 활성화 된 자동 반응성 T 림프구가 건강한 CNS로 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 교차하고 EAE 질병을 개시하는 면역 징후입니다. MOG 35-55 Ag가 발생하면, 이러한 T 림프구는 염증과 이펙터 세포의 모집을 CNS로 유도하여 탈근및 축축 파괴8,,9의결과이다. EAE 모델에서는 신경항원 특이적CD4+ T 세포가 신경염증 및 병리학3,,10을시작하고 유지할 수 있다는 충분한 증거가 있다. 생산된 주요 사이토카인에 따라 CD4+ T 림프구는 다른 하위 집합으로 분류되었습니다: Th1 (인터페론 γ 생산 특징), Th2 (인터류킨 4의 생산 특징), Th17 (인터류킨 17의 생산에 의해 특징). Th1 과 Th17 세포의 활성화는 대식세포 활성화 및 염증 부위에 호중구를 모집할 수 있는 이펙터 사이토카인 IFN-γ 및 IL-17을 분비함으로써 EAE 및 MS의 염증성 탈생의 유도,11유지 및 조절에 기여하는 것으로 여겨진다.
자동 반응성 T 세포가 CBB를 CNS로 교차하고 MS 및 EAE에서 질병의 발달을 유도하기 때문에 CNS에서 T 세포를 분석하는 것이 매우 중요합니다. 그러나, CNS12로부터림프구의 분리를 위한 확립된 프로토콜은 거의 없다. 따라서, 뇌로부터 단핵세포를 분리하고 마커 CD45, CD3, CD4, INF-g 및 IL-17을 사용하여 뇌로부터 단핵세포를 분리하고 T 림프구를 분석하는 데 최적화된 방법이 개발되었다. 이 방법은 MOG35-55 보조 균 결핵 H37 라와 백혈구 독소 작업 용액 (PTX)을 사용하여 마우스에서 EAE의 활성 예방 접종 모델을 유도합니다. 이어서, 기계적 분리 및 밀도 그라데이션 원심분리 방법은 CNS 단핵세포의 분리를 위해 사용된다. 마지막으로, 최적화된 유동 세포측정 게이팅 전략은 여러 마커를 염색하여 뇌에서 T 림프구와 하위 집합을 식별하는 데 사용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구는 C57BL/6 마우스에서 MOG35-55를 사용하여 EAE를 유도하고 모니터링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 EAE MS의 전형적인 신경면역 실험 동물 모델로 간주되는 것으로 간주되어 연구의 목적에 따라 유도에 사용되는 마우스 균주 또는 단백질의 종류를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, SJL 마우스에서 PLP139-151 펩티드를 사용하면 재발에 대한 치료 효과를 평가하기에 특히 적합한 재발-방출 EAE 질병 과?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연과학 재단(31570921 ~ZJ, 81571533 ~ LS), 상하이 시 보건위원회 및 가족 계획 (201540206 ~ ZJ), 루이진 병원 노스 연구 보조금 (2017ZX01 )
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
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