Цитометрический анализ инфильтрации лимфоцитов в Центральной нервной системе во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита
Summary
Эта рукопись представляет собой протокол, чтобы вызвать активный экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЭ) у мышей. Метод изоляции и характеристики проникли лимфоцитов в центральной нервной системе (ЦНС) также представлен, чтобы показать, как лимфоциты участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний ЦНС.
Abstract
Рассеянный склероз (МС) является аутоиммунным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), вызванным сочетанием факторов окружающей среды и восприимчивого генетического фона. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЭ) является типичной моделью заболевания MS широко используется для исследования патогенеза, в котором Т-лимфоциты, характерные для миелин антигенов инициировать воспалительные реакции в ЦНС. Очень важно оценить, как лимфоциты в ЦНС регулируют развитие болезни. Тем не менее, подход к измерению количества и качества проникли лимфоцитов в ЦНС очень ограничен из-за трудностей в изоляции и обнаружения проникли лимфоцитов из мозга. Эта рукопись представляет собой протокол для того, что полезно для изоляции, идентификации и характеристики проникли лимфоцитов из ЦНС и будет полезно для нашего понимания того, как лимфоциты участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний ЦНС.
Introduction
Как хроническое демиелинизирующей болезни ЦНС, MS затрагивает около 2,5 миллионов человек во всем мире и не хватает лечебноголечения 1. Он также считается аутоиммунным заболеванием, при котором миелин антиген специфических Т-лимфоцитов инициировать воспалительные реакции и привести к демиелинизации и аксональной травмы вЦНС 2. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) широко используется для исследования патогенных механизмов MS как классическая модель аутоиммунных демиелинизации вЦНС 3. Есть два способа индуцировать ЕАЭ: один заключается в том, чтобы индуцировать EAE активно иммунизации животных с компонентами миелина, другой является приемная передача путем передачи энцефалитогенныхТ-клеток в рецептор 2,4,5. Восприимчивость к ЕАЕ различна в различных штаммах животных6. У мышей C57BL/6, миелин олигодендроцит гликопротеин (MOG) 35-55 вызов вызывает монофазное заболевание с обширной демиелинизации и воспаления в ЦНС, который часто используется в экспериментах с генно-целевыхмышей 7.
Генерация миелин-специфических реактивных Т-клеток необходима для возникновения и развития заболевания в ЕАЭ и является иммунологическим признаком как ЕАЕ, так и MS. Активированные аутореактивные Т-лимфоциты пересекают геммозефалический барьер (BBB) в здоровую ЦНС и инициируют болезнь ЕАЭ. Когда MOG 35-55 Ag встречается, эти Т-лимфоциты вызывают воспаление и набор клеток-эффекторов в ЦНС, что приводит к демиелинизации и разрушениюаксона 8,9. В модели EAE, есть достаточно доказательств того, что нейроантиген-специфические CD4И Т-клетки могут инициировать и поддерживать нейровоспламенениеи патологию 3,10. В зависимости от основных производимых цитокинов,CD4 и T лимфоциты были классифицированы на различные подмножества: Th1 (характеризуется производством интерферона-γ), Th2 (характеризуется производством интерлейкина 4) и Th17 (характеризуется производством интерлейкина 17). Считается, что активация клеток Th1 и Th17 способствует индукции, техническому обслуживанию и регуляции воспалительной демиелинизации в ЕАЭ и МС путем секреции эффекторных цитокинов IFN-γ и IL-17, которые способны активировать макрофаги и набирать нейтрофилов ввоспалительные участки для ускорения поражений 11.
Поскольку аутореактивные Т-клетки пересекают BBB в ЦНС и вызывают развитие болезни в MS и EAE, очень важно анализировать Т-клетки в ЦНС. Тем не менее, Есть очень мало установленных протоколов для изоляции лимфоцитов от ЦНС12. Поэтому был разработан метод, оптимизированный для изоляции моноядерных клеток из мозга и анализа Т-лимфоцитов с маркерами CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g и IL-17 для цитометрии потока. Метод использует MOG35-55 адъювант mycobacterium туберкулеза H37 Ra и коклюша токсина рабочего решения (PTX), чтобы вызвать активную модель иммунизации ЕАЭ у мышей. Затем для изоляции моноядерных клеток ЦНС используются методы механического разделения и центрифугации плотности. Наконец, оптимизированная стратегия цитометрии потока используется для идентификации Т-лимфоцитов и подмножества из мозга путем окрашивания нескольких маркеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование представляет собой протокол для индуцирования и мониторинга ЕАЕ с использованием MOG35-55 у мышей C57BL/6, которые считаются типичной нейроиммунологической экспериментальной животной моделью MS. EAE может быть индуцирована с изменением штаммов мышей или типа белка, используе…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая гранта (31570921 к йД, 81571533 lS), Шанхай муниципальной комиссии по здравоохранению и планированию семьи (201540206 до йД), Ruijin больницы Северный научно-исследовательский грант (2017’X01 до йJ).
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
