ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム
Summary
ランチペプチド合成酵素は、ペプチド天然物の生合成中に多段階反応を触媒する。ここでは、ランチペプチド合成酵素の立体ダイナミクス、ならびにペプチド天然物生合成に関与する他の同様の酵素を研究するために使用できる、連続的なボトムアップ、水素重水素交換質量分析(HDX-MS)ワークフローについて述べています。
Abstract
水素重水素交換質量分析(HDX-MS)は、酵素の立体構造変化と酵素基質相互作用の生物物理特性解析に対する強力な方法です。その多くの利点の中で、HDX-MSは少量の材料しか消費せず、酵素/基質標識を必要とせずに近い天然条件下で行うことができるので、大きな酵素および多タンパク質複合体に対しても酵素立体構造ダイナミクスに関する空間的に解決された情報を提供することができます。この方法は、D2Oで調製した緩衝液への目的の酵素の希釈によって開始される。これは、重水素(N-D)とのペプチド結合アミド(N-H)中のプロチウムの交換を引き起こす。所望の交換時点で、反応アリコートがクエンチされ、酵素がペプチドにタンパク質化され、ペプチドが超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)によって分離され、各ペプチドの質量の変化(重水素に対する水素交換による)がMSによって記録される。各ペプチドによる重水素の取り込みの量は、そのペプチドの局所水素結合環境に強く依存する。酵素交換重水素の非常に動的な領域に存在するペプチドは非常に迅速に存在するのに対し、整然とした領域に由来するペプチドは、はるかにゆっくりと交換を受ける。このようにして、HDXレートは局所的な酵素立体構造ダイナミクスについて報告する。異なるリガンドの存在下で重水素の取り込みレベルへの摂動は、リガンド結合部位をマッピングし、アロステリックネットワークを同定し、酵素機能における立体構造ダイナミクスの役割を理解するために使用することができる。ここでは、ランチペプチドと呼ばれるペプチド天然物の生合成をより深く理解するためにHDX-MSを使用した方法を説明します。ランチペプチドは、従来の構造生物学のアプローチでは研究が困難な大規模で多機能な構造動的酵素によって翻訳後に修飾される遺伝的にコードされたペプチドです。HDX-MSは、これらのタイプの酵素の機械特性を調査するための理想的で適応可能なプラットフォームを提供します。
Introduction
タンパク質は、フェムト秒スケールの結合振動から、何秒間にわたって起こり得るタンパク質ドメイン全体の再配置に至るまで、時間スケールで異なる立体構造をサンプリングする構造的に動的な分子である1。これらの立体構造変動は、しばしば酵素/タンパク質機能の重要な側面です。例えば、リガンド結合によって誘導される立体構造変化は、触媒に必要な活性部位残基を組織し、連続的な運動機構で基質結合部位を定義し、反応性中間体を環境から遮蔽するか、またはアロステリックネットワークを介して酵素機能を調節することによって、酵素機能を調節するために非常に重要である。最近の研究では、立体構造ダイナミクスは進化を通して保存することができ、保存された分子運動への摂動は基質特異性の変化および新しい酵素機能の出現と相関することができることを示している2,3。
近年、水素-重水素交換質量分析(HDX-MS)は、リガンド結合や変異形成などの摂動にタンパク質の立体構造の景観がどのように応答するかを調査する強力な技術として急速に出現している4、5、6、7。典型的なHDX-MS実験(図1)では、目的のタンパク質をD2Oで調製したバッファーに入れ、溶媒交換可能なプロトンを重水素に置換する。ペプチド結合のアミド部分の交換速度は、pH、局所アミノ酸配列、およびアミド8の局所構造環境に強く依存する。水素結合相互作用に関与しているアミド(αヘリックスやβシートに存在するものなど)は、バルク溶媒にさらされているタンパク質の非構造化領域のアミドよりもゆっくりと交換します。したがって、重水素の取り込みの程度は、酵素の構造の反映である。立体構造が動的な酵素、またはリガンド結合時に構造的な転移を起す酵素は、測定可能なHDX応答をもたらすと予想されるであろう。
構造化アミドの遅い為替レートの機械化基準を図25,8,9に示します。HDXを受けるためには、特定の酸/塩基化学機構を介してHDX交換を触媒する溶媒分子が交換可能なアミドにアクセスできるように、まず一時的に展開された立体構造をサンプリングする必要があります。最終的に、化学為替レート(kchem)と折り畳み速度(kオープンおよびkクローズ)の相対マグニチュードは、実験5,8で測定されたHDXレートを決定する。この単純な運動モデルから、重水素取り込みの程度が基礎となる立体ダイナミクス(kopenとk close)を反映することは明らかです。ほとんどのHDX-MS実験は、交換反応に続いて、目的のタンパク質がペプチドに消化され、各ペプチドによる重水素取り込みが質量7の増加として測定されるボトムアップワークフローで行われる。このように、HDX-MSは、酵素立体構造ダイナミクスへの摂動をペプチドの局所空間スケールにマッピングすることを可能にし、摂動が目的の酵素の異なる領域のダイナミクスをどのように変化させるかを評価することを可能にする。
タンパク質構造力学を解明するためのHDX-MSアプローチの利点は数多くあります。まず、この方法は、第四級構造10の系において少量の天然タンパク質またはタンパク質複合体に対して実施することができる。ボトムアップHDX-MSワークフローが目的のタンパク質配列をカバーする十分な数の確実に同定されたペプチドを提供する限り、アッセイに使用される酵素調製物が高度に精製される11,12である必要さえありません。さらに、HDX-MSは、単一分子蛍光研究13で用いられるような部位特異的タンパク質標識を必要とせずに、近い在来条件下での立体構造ダイナミクスに関する情報を提供することができ、また、調査できるタンパク質またはタンパク質複合体(核磁気共鳴[NMR]分光法などのアプローチを困難にする)にサイズ制限はない。最後に、時間分解HDX-MS法は、X線結晶学15、16、17、18で研究することが困難である本質的に障害を持つタンパク質を研究するために使用することができる。HDX-MSの主な制限は、データが低い構造分解能であるということです。HDX-MSデータは、立体ダイナミクスが変化している場所を指し示し、結合された立体構造の変化を明らかにするのに役立ちますが、観察された変化を駆動する正確な分子メカニズムに関する多くの洞察を提供することはあまりありません。電子捕獲解離法とタンパク質HDX-MSデータの組み合わせにおける最近の進歩は、交換部位を単一アミノ酸残基19にマッピングする約束を示しているが、HDX-MSデータによって転送される構造モデルを明確にするために、生化学的および構造的研究をフォローアップすることが依然としてしばしば必要である。
以下、HDX-MSアッセイの開発のための詳細なプロトコルが20を提示される。以下に示すサンプル調製プロトコルは、一般的に、水性バッファーに良好な溶解性を示す任意のタンパク質に適用できる必要があります。より特殊なサンプル調製方法およびHDX-MSワークフローは、洗浄剤またはリン脂質21、22、23、24の存在下でのアッセイが必要以上にタンパク質に対して利用可能である。HDX-MS データ収集のインストゥルメンタル設定は、液体クロマトグラフィー システムに結合された高分解能の四重極時間質量分析計について説明されています。同様の複雑性と分解能のデータは、市販の液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)システムの中から収集できます。市販のソフトウェアパッケージを用いたデータ処理の重要な側面も提供される。また、より広範な HDX-MS コミュニティ12の推奨事項と一致するデータ収集と分析のガイドラインも示します。本記載のプロトコルは、HalM2の動的構造特性を研究するために用いられる、抗菌ペプチド天然物20の多段階成熟を触媒するランチペプチド合成酵素である。我々は、HDX-MSを用いて、これまでの特徴付けが排除された基質結合部位およびアロステリック特性を明らかにする方法を示す。タンパク質HDX-MSに関する他のいくつかのプロトコルが近年25,26で公開されている。現在の作業と共に、これらの以前の貢献は、読者に実験計画のいくつかの柔軟性を提供する必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルで提示されるHDX-MSワークフローは、タンパク質中の構造的に動的な要素の空間分布をマッピングし、これらのダイナミクスが摂動(リガンド結合、酵素変異生成など)にどのように変化するかを調査するための非常に堅牢なプラットフォームを提供します。HDX-MSは、立体構造ダイナミクスの調査に一般的に使用される他の構造生物学アプローチに対して、いくつかの明確な利点?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会、ケベック自然とテクノロジー、カナダイノベーション財団、マギル大学のスタートアップ資金によって支援されました。
Materials
| Reagents | |||
| [glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
| potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
| TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
| DynamX | Waters | version 3.0 | |
| MassLynx | Waters | version 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Instrument and equipment | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
| HDX Manager | Waters | ||
| microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
| Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
| Waters Synapt G2-Si | Waters |
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