펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼
Summary
Lanthipeptide 는 펩타이드 천연 제품의 생합성 중에 다단계 반응을 촉매합니다. 여기서, 우리는 펩타이드 천연 제품 생합성에 관여하는 다른 유사한 효소뿐만 아니라 란티페타이드 신디사이저의 형성 역학을 연구하기 위해 사용될 수 있는 연속, 상향식, 수소 중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS) 워크플로우를 설명합니다.
Abstract
수소-황량제 교환 질량 분석법(HDX-MS)은 효소 형태 변화와 효소 기질 상호작용의 생체물리학적 특성화를 위한 강력한 방법입니다. HDX-MS는 소량의 물질만 소비하며, 효소/기질 라벨링 없이 근동 조건하에서 수행할 수 있으며, 큰 효소 및 다단백 복합체에서도 효소 형성 역학에 대한 공간적으로 해결된 정보를 제공할 수 있습니다. 이 방법은D2O에서 제조된 완충제로 관심 있는 효소의 희석에 의해 개시된다. 이것은 중수소 (N-D)를 가진 펩티드 본드 아마이네스 (N-H)에서 프로티움의 교환을 트리거합니다. 원하는 교환 시점에서, 반응 알리쿼트가 담금질되고, 효소는 펩티드로 프로테오리제화되고, 펩타이드는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)에 의해 분리되고, 각 펩타이드의 질량의 변화(중수소용 수소의 교환로 인해)는 MS에 의해 기록된다. 각 펩티드에 의한 중수소 섭취량의 양은 해당 펩티드의 국소 수소 결합 환경에 크게 의존한다. 펩타이드는 효소 교환 중음류의 매우 역동적인 부위에 매우 빠르게 존재하는 반면, 잘 정렬된 지역에서 유래된 펩타이드는 훨씬 더 느리게 교환을 받는다. 이러한 방식으로, HDX 속도 로컬 효소 형성 역학에 대 한 보고서. 다른 리간드가 있는 중수소 섭취량 수준에 대한 혼란은 리간드 결합 부위를 매핑하고, 알로스터 네트워크를 식별하고, 효소 기능에서 형성 역학의 역할을 이해하는 데 사용될 수 있다. 여기에서, 우리는 우리가 더 나은 lanthipeptides에게 불린 펩티드 천연 제품의 모형의 생합성을 이해하기 위하여 HDX-MS를 이용한 방법을 보여줍니다. Lanthipeptides는 전통적인 구조 생물학 접근으로 공부하기 어려운 크고 다기능, 형태역학적 효소에 의해 번역 후 변형되는 유전자 로코딩된 펩티드입니다. HDX-MS는 이러한 유형의 효소의 기계적인 특성을 조사하기 위한 이상적이고 적응력이 뛰어난 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
단백질은 펨토초 규모의 결합 진동에서부터 여러 초 동안 발생할 수 있는 전체 단백질 도메인의 재배열에 이르기까지 시간 척도에 따라 다른 적합성을 샘플링하는 구조적으로 역동적인분자입니다. 이러한 형태 적 변동은 종종 효소 / 단백질 기능의 중요한 측면입니다. 예를 들어, 리간드 결합에 의해 유도된 형태 변화는 촉매에 필요한 활성 부위 잔류물을 구성하거나, 순차적 운동 메커니즘에서 기판 결합 부위를 정의하거나, 환경에서 반응성 중간체를 차폐하거나, 알로스티아 네트워크를 통해 효소 기능을 조절함으로써 효소 기능을 조절하는 데 매우 중요합니다. 최근 연구에 따르면 형태 역학은 진화 전반에 걸쳐 보존될 수 있으며 분자 운동을 보존하는 혼란은 기판 특이성의 변화와 새로운 효소 기능2,3의출현과 상관관계가 있을 수 있음을 보여주었다.
최근 몇 년 동안 수소-중수소 교환 질량 분광법(HDX-MS)은 단백질 형성 경관이 리간드 결합 또는 돌연변이 발생4,5,6,7과같은 동요에 어떻게 반응하는지 조사하는 강력한 기술로 급속히부상하고 있다. 전형적인 HDX-MS실험(도 1)에서관심 있는 단백질은 D2O로 제조된 완충제에 배치되어, 이는 신테리아를 가진 용매 교환 성수기의 교체를 유발한다. 펩티드 결합의 아미드 모이티의 교환 속도는 pH, 국소 아미노산 서열 및 아미드8의국소 구조 환경에 크게 의존한다. 수소 결합 상호 작용에 종사하는 아미드 (예 : α-헬릭 및 β 시트에 존재하는 것과 같은)은 대량 용매에 노출되는 단백질의 구조화되지 않은 영역에서 아미드보다 더 느리게 교환됩니다. 따라서, 중수소 섭취의 정도는 효소의 구조를 반영한다. 형태역학적 이거나 리간드 결합 시 구조적 전이를 겪는 효소는 측정 가능한 HDX 응답을 얻을 것으로 예상됩니다.
구조화된 아마이드의 느린 환율에 대한 기계론적 기초는 도 25,8,9로도시된다. HDX를 받기 위해서는, 구조화된 영역은 먼저 전개된 형성을 일시적으로 샘플링해야 하며, 이러한 용매 분자는 특정 산/염기 화학 메커니즘을 통해 HDX 교환을 촉매하는, 교환 가능한 아미드에 접근할 수 있다. 궁극적으로,화학환율(kchem)과접이식 및 재접이식 비율(kopen 및 kclose)의상대적 크기는 실험5,8에서측정된 HDX 속도를 결정한다. 이 간단한 운동 모델에서, 중수소 섭취량의 정도는 기본 형태 역학을 반영할 것이 분명하다 (k열기 및 k닫기에의해 정의). 대부분의 HDX-MS 실험은 상향식 워크플로우에서 수행되며, 교환 반응에 따라 관심 있는 단백질이 펩타이드로 소화되고 각 펩티드에 의한 중수소 흡수량은 질량7의증가로 측정된다. 이러한 방식으로, HDX-MS는 효소 형성 역학에 대한 교란을 펩티드의 로컬 공간 척도에 매핑할 수 있게 하여, 연구자가 동요가 관심 있는 효소의 다른 영역에서 역학을 어떻게 변화시키는지 평가할 수 있게 합니다.
단백질 구조 역학을 해명하기 위한 HDX-MS 접근법의 장점은 다양합니다. 먼저, 이 방법은 사분위구조(10)를가진 시스템에서 소량의 토종 단백질 또는 단백질 복합체로 수행될 수 있다. 분석에서 사용되는 효소 제제는11,12,상향식 HDX-MS 워크플로우가 단백질 서열을 커버하는 충분한 수의 자신있게 확인된 펩티드를 제공하는 한, 고도로 정제될 필요가 없다. 더욱이, HDX-MS는 단일 분자 형광연구에서사용되는 바와 같이 현장별 단백질 라벨링필요 없이 근사 조건하에서 형성 역학에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 조사할 수 있는 단백질 또는 단백질 복합체에 대한 크기 제한은 없다(핵자기 공명[NMR] 분광법 도전과 같은 접근법을 만드는)7,14. 마지막으로, 시간 해결된 HDX-MS 방법은 X선결정학15,16,17,18로공부하기 어려운 본질적으로 무질서한 단백질을 연구하기 위하여 이용될 수 있다. HDX-MS의 주요 제한사항은 데이터가 낮은 구조적 해상도라는 것입니다. HDX-MS 데이터는 형태 역학이 변화하는 곳을 가리키고 결합된 형태 변화를 드러내는 데 유용하지만 관찰된 변화를 유도하는 정확한 분자 메커니즘에 대한 많은 통찰력을 제공하지는 않습니다. 단백질 HDX-MS 데이터와 전자 포획 해리 방법의 조합에 있는 최근 발전은 단 하나 아미노산 잔류물19에교환 사이트를 매핑하는 약속을 보여주었습니다, 그러나 후속 생화확적인 및 구조 적인 연구는 아직도 HDX-MS 데이터에 의해 전달된 구조 모형에 명확성을 제공하기 위하여 수시로 필요합니다.
아래, HDX-MS 분석기의 개발을 위한 자세한 프로토콜이20을제시한다. 아래에 제시된 견본 준비 프로토콜은 수성 완충제에 있는 좋은 용해도를 전시하는 어떤 단백질든지 일반적으로 적용되어야 합니다. 세제 또는 인지질(21,22,23,24)의존재에서 분석될 필요가 없는 것보다 더 전문적인 시료 제조 방법및HDX-MS 워크플로우를 단백질에 사용할 수있다. HDX-MS 데이터 수집을 위한 기악 설정은 액체 크로마토그래피 시스템에 결합된 고해상도 쿼드러폴 비행 시간 질량 분광계에 대해 설명됩니다. 유사한 복잡성 과 해상도의 데이터는 상업적으로 이용 가능한 다수의 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS) 시스템에서 수집될 수 있습니다. 시판되는 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터 처리의 주요 측면도 제공됩니다. 또한 광범위한 HDX-MS 커뮤니티12의권장 사항과 일치하는 데이터 수집 및 분석에 대한 지침을 제시합니다. 기재된 프로토콜은 항균 펩티드천연물(20)의다단계 성숙을 촉매하는 란티펩타이드 합성물인 HalM2의 동적 구조적 특성을 연구하는 데 사용된다. 우리는 HDX-MS가 기판 바인딩 사이트와 이전 특성을 벗어난 알로스터 속성을 공개하는 데 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다. 단백질 HDX-MS에 대한 몇몇 그밖 프로토콜은 최근25,26에서간행되었습니다. 현재 작업과 함께 이러한 초기 기여는 독자에게 실험 설계에 약간의 유연성을 제공해야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 제시된 HDX-MS 워크플로우는 단백질의 구조적으로 역동적인 요소의 공간 분포를 매핑하고 이러한 역학이 변투(리간드 결합, 효소 돌연변이 발생 등)에 대한 응답으로 어떻게 변화하는지 조사하기 위한 매우 견고한 플랫폼을 제공합니다. HDX-MS는 일반적으로 형성 역학을 조사하는 데 사용되는 다른 구조 생물학 접근 방식에 비해 몇 가지 뚜렷한 이점을 보유하고 있습니다. 특히 소량의…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회, 퐁드 드 레체슈 뒤 퀘벡 자연 에 테크놀로지, 혁신을위한 캐나다 재단, 맥길 대학 창업 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagents | |||
| [glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
| potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
| TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
| DynamX | Waters | version 3.0 | |
| MassLynx | Waters | version 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Instrument and equipment | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
| HDX Manager | Waters | ||
| microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
| Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
| Waters Synapt G2-Si | Waters |
References
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