En plattform för vätedeuteriumutbyte av masspektrometri (HDX-MS) för undersökning av peptidbiosyntetiska enzymer

Summary

Lanthipeptid synthetases katalyserar multistepreaktioner under biosyntesen av peptid naturliga produkter. Här beskriver vi ett kontinuerligt, bottom-up, väte-deuterium utbyte masspektrometri (HDX-MS) arbetsflöde som kan användas för att studera konformationsdynamiken hos lanthipeptid synthetases, liksom andra liknande enzymer som är involverade i peptid naturliga produkt biosyntes.

Abstract

Väte-deuterium utbyte masspektrometri (HDX-MS) är en kraftfull metod för biofysisk karakterisering av enzym conformational förändringar och enzym-substrat interaktioner. Bland dess många fördelar konsumerar HDX-MS endast små mängder material, kan utföras under nära inhemska förhållanden utan behov av enzym / substratmärkning och kan ge rumsligt löst information om enzymkonformationsdynamik−även för stora enzymer och multiproteinkomplex. Metoden initieras genom utspädning av enzymet av intresse till buffert beredd i D₂O. Detta utlöser utbytet av protium i peptidbindning mitt i (N-H) med deuterium (N-D). Vid önskade utbytespunkter släcks reaktions alikvoter, enzymet proteolyseras i peptider, peptiderna separeras av ultraprestanda flytande kromatografi (UPLC) och förändringen i massan av varje peptid (på grund av utbyte av väte mot deuterium) registreras av MS. Mängden deuteriumupptag vid varje peptid är starkt beroende av den lokala vätebindningsmiljön för den peptiden. Peptider som förekommer i mycket dynamiska regioner i enzymutbytesdeuterium mycket snabbt, medan peptider som härrör från välbeställda regioner utbytes mycket långsammare. På detta sätt rapporterar HDX-hastigheten om lokal enzymkonformationsdynamik. Perturbations till deuteriumupptag jämnar i närvaroen av olika ligands kan därefter användas för att kartlägga ligand bindningplatser, identifiera allosteric knyter kontakt, och att förstå rollen av conformational dynamik i enzym fungerar. Här illustrerar vi hur vi har använt HDX-MS för att bättre förstå biosyntesen av en typ av peptid naturliga produkter som kallas lanthipeptider. Lanthipeptider är genetiskt kodade peptider som efter translationellt modifieras av stora, multifunktionella, konformationellt dynamiska enzymer som är svåra att studera med traditionella strukturbiologiska metoder. HDX-MS ger en idealisk och anpassningsbar plattform för att undersöka de mekanistiska egenskaperna hos dessa typer av enzymer.

Introduction

Proteiner är strukturellt dynamiska molekyler som provar olika konformationer på tidsskalor som sträcker sig från femtosekrerade bindningsvibrationer till omorganiseringar av hela proteindomäner som kan uppstå under många sekunder¹. Dessa conformational fluktuationer är ofta kritiska aspekter av enzym/protein funktion. Till exempel är konformationsförändringar som induceras av ligandbindning ofta kritiskt viktiga för att modulera enzymfunktionen, antingen genom att organisera aktiva rester som behövs för katalys, definiera substratbindningsplatser i sekventiella kinetiska mekanismer, skydda reaktiva intermediärer från miljön eller genom att modulera enzymfunktionen via allosteriska nätverk. Nyligen genomförda studier har också visat att konformationsdynamik kan bevaras genom hela evolutionen och att förändringar i bevarade molekylära rörelser kan korreleras med förändringar i substratspecifikitet och uppkomsten av nya enzymfunktioner^2,3.

Under de senaste åren har vätedeuteriumutbyte masspektrometri (HDX-MS) snabbt dykt upp som en kraftfull teknik för att undersöka hur proteinkonformationslandskap reagerar på stör som ligandbindning eller mutagena^4,5,6,7. I ett typiskt HDX-MS-experiment (figur 1) placeras ett protein av intresse i en buffert som bereds i D₂O, vilket utlöser ersättning av lösningsmedelsbytbara protoner med deuteria. Utbyteskursen för peptidbindningarna mitt i peptidbindningarna beror starkt på pH, den lokala aminosyrasekvensen och på den lokala strukturella miljön i^{amidet 8}. Amides som är engagerade i vätebindningsinteraktioner (som de som finns i α-helices och β-ark) utbyter långsammare än mitt i ostrukturerade områden av proteinet som utsätts för bulklösningsmedel. Således är omfattningen av deuteriumupptag en återspegling av enzymets struktur. Enzymer som är konformationellt dynamiska, eller som genomgår strukturella övergångar på ligandbindning, förväntas ge ett mätbart HDX-svar.

Den mekanistiska grunden för den långsamma växelkursen för ett strukturerat amid visas i figur 2^5,8,9. För att genomgå HDX måste den strukturerade regionen först tillfälligt ta prov på en utfälld konformation, så att lösningsmedelsmolekylerna som katalyserar HDX-utbyte via en specifik syra/baskemisk mekanism har tillgång till det utbytbara amidet. I slutändan bestämmer de relativa magnituderna för den kemiskaväxelkursen (k_chem)och viknings- och omviktningshastigheterna(k_öppna och k_nära)den HDX-kurs som mäts i^{experimentet 5,8}. Från denna enkla kinetiska modell är det uppenbart att omfattningen av deuteriumupptaget kommer att återspegla den underliggande konformationsdynamiken (enligt definitionen av k_öppen och k_nära). De flesta HDX-MS-experiment utförs i ett bottom-up arbetsflöde där, efter utbytesreaktionen, proteinet av intresse smälts in i peptider och deuteriumupptaget av varje peptid mäts som en ökning av massa⁷. På detta sätt tillåter HDX-MS att perturbationer till enzymkonformationsdynamik kartläggs på den lokala rumsliga skalan av peptider, vilket gör det möjligt för forskaren att bedöma hur stören förändrar dynamiken i olika regioner av enzymet av intresse.

Fördelarna med HDX-MS-metoden för att belysa proteinstrukturdynamiken är många. För det första kan metoden utföras med små mängder inhemskt protein eller på proteinkomplex i system med kvartärstruktur¹⁰. Det är inte ens nödvändigt att enzympreparatet som används i analysen är mycket^{renat 11,12}, så länge det nedifrån och upp HDX-MS-arbetsflödet ger ett tillräckligt antal säkert identifierade peptider som täcker proteinsekvensen av intresse. Dessutom kan HDX-MS ge information om konformationsdynamik under nästan inhemska förhållanden utan behov av platsspecifik proteinmärkning som skulle användas i fluorescensstudier^{med en molekyl 13}, och det finns ingen storleksgräns för proteinet eller proteinkomplexet som kan undersökas (vilket gör tillvägagångssätt som kärnmagnetisk resonans [NMR] spektroskopi utmanande)^7,14. Slutligen kan tidsbefriade HDX-MS-metoder användas för att studera inneboende oordnade proteiner, som är svåra att studera med röntgenkristallografi^15,16,17,18. Den huvudsakliga begränsningen av HDX-MS är att data är av låg strukturell upplösning. HDX-MS-data är användbara för att peka på var konformationsdynamiken förändras och för att avslöja kopplade konformationsförändringar, men de ger inte ofta mycket insikt i den exakta molekylära mekanismen som driver den observerade förändringen. De senaste framstegen i kombinationen av elektronfångstdisociationsmetoder med protein HDX-MS-data har visat löfte om att kartlägga utbytesplatser till enskilda aminosyrarester¹⁹, men uppföljning av biokemiska och strukturella studier behövs fortfarande ofta för att ge klarhet till strukturella modeller som vidarebefordras av HDX-MS-data.

Nedan presenteras ett detaljerat protokoll för utveckling av en HDX-MS-analys²⁰. De provberedningsprotokoll som presenteras nedan bör i allmänhet tillämpas på alla proteiner som uppvisar god löslighet i vattenhaltiga buffertar. Mer specialiserade provberedningsmetoder och HDX-MS-arbetsflöden finns tillgängliga för proteiner än vad som behöver analyseras i närvaro av tvättmedel eller fosfolipider^21,22,23,24. Instrumentella inställningar för HDX-MS datainsamling beskrivs för en högupplöst fyrdubbel flygtidsmasspektrometer i kombination med flytande kromatografisystem. Data om liknande komplexitet och upplösning kan samlas in på något av ett antal kommersiellt tillgängliga vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) system. Viktiga aspekter av databehandlingen med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt programvarupaket tillhandahålls också. Vi presenterar också riktlinjer för datainsamling och analys som överensstämmer med rekommendationerna från den bredare HDX-MS-communityn¹². Det beskrivna protokollet används för att studera de dynamiska strukturella egenskaperna hos HalM2, en lanthipeptidsyntetas som katalyserar multistepsmognaden hos en antimikrobiell peptid naturlig produkt²⁰. Vi illustrerar hur HDX-MS kan användas för att avslöja substratbindningsplatser och allosteriska egenskaper som har gäckat tidigare karakterisering. Flera andra protokoll om protein HDX-MS har publicerats under de senaste åren^25,26. Tillsammans med det nuvarande arbetet bör dessa tidigare bidrag ge läsaren viss flexibilitet i experimentell design.

Protocol

1. Beredning av avutererade reagenser och enzymlagerlösningar Förbered reagenser som behövs för HDX-reaktionerna (inklusive eventuella buffertar, salter, substrat, ligands, etc.) som 100−200x koncentrerade stamlösningar i D2O (99,9% atomfraktion D). Förbered minst 50 ml buffertlagerlösning.OBS: För karakterisering av HalM2 utarbetades följande lösningar: 500 mM MgCl2,100 mM tris (2-carboxyetyl)fosfin (TCEP), 750 mM ATP (i HEPES-buffert), 800 mM HEPES pD 7,1, 500 μM HalA2 o…

Representative Results

Det är nödvändigt att bedöma kvaliteten på den proteolytiska matsmältningen och reproducerbarheten av arbetsflödet för varje uppsättning provinjektioner. Innan HDX-MS-analyser utfördes är det därför viktigt att fastställa effektiva förutsättningar för proteolys av det protein som är av intresse, för separation av peptider med hjälp av omvänd fas flytande kromatografi och gasfasjonrörlighet och för påvisande av peptider med ms. För detta ändamål bör referensproverna för protein av intresse (so…

Discussion

HDX-MS-arbetsflödet som presenteras i detta protokoll ger en anmärkningsvärt robust plattform för kartläggning av rumslig fördelning av strukturellt dynamiska element i proteiner och för att undersöka hur dessa dynamik förändras som svar på stör (ligandbindning, enzym mutagenes, etc.). HDX-MS har flera tydliga fördelar jämfört med andra strukturella biologimetoder som ofta används för att undersöka konformationsdynamik. Framför allt behövs endast små mängder protein. Med hjälp av arbetsflödet som …

Materials

Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)	BioBasic	NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore)	Milipore Sigma	UFC501096
acetonitrile	Fisher	A955-1
AMP-PNP	SIGMA	A2647-25MG
ATP	SIGMA	a2383-5G
D2O	ALDRICH	435767-100G
formic acid	Thermo Fisher	28905
guanidine-HCl	VWR	97063-764
HEPES	Fisher	BP310-1
Magnesium chloride	SiGMA-Aldrich	63068-250G
Potassium chloride	BioBasic	PB0440
potassium phosphate	BioBasic	PB0445
TCEP Hydrochloride	TRC Canada	T012500	peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
software
Deuteros	Andy M C Lau, et al	version 1.08
DynamX	Waters	version 3.0
MassLynx	Waters	version 4.1
Protein Lynx Global Server (PLGS)	Waters	version 3.0.3
PyMOL	Schrödinger	version 2.2.2
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column	Waters	186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column	Waters	186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System	Waters
HDX Manager	Waters
microtip pH electrode	Thermo Fisher	13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn	Waters	186007233
Waters Synapt G2-Si	Waters