MeCP2タンパク質変異体に対するエレクトロケミセンスベースアッセイ
1Institute of Medical Genetics, Center for Pathobiochemistry and Genetics,Medical University of Vienna (MUV), 2Murdoch Children’s Research Institute and Department of Paediatrics, University of Melbourne, Discipline of Child & Adolescent Health,Sydney Medical School, 3Department of Medical Chemistry and Pathobiochemistry,Medical University of Vienna
Summary
エレクトロケミ発光免疫測定法(ECLIA)は、内因性および外因的に適用されたMeCP2タンパク質変異体の定量的検出のための新しいアプローチであり、幅広い作業範囲での低いイントラおよびインターアッセイ誤差で定量的、正確、再現性の高い測定を行います。ここでは、96 ウェル形式での MeCP2-ECLIA のプロトコルについて説明します。
Abstract
ECLIAは、96ウェル形式で内因性および組換えタンパク質量を定量化することができる汎用性の高い方法です。ECLIAの効率を実証するために、このアッセイは、マウス脳組織におけるMeCP2の本質的なレベルとヒト真皮線維芽細胞におけるTAT-MeCP2の取り込みの分析に使用された。MeCP2-ECLIAは、低いイントラおよびインターアッセイ誤差で、高精度で再現性の高い測定を行います。要約すると、高スループットスクリーンで利用できるMeCP2タンパク質変異体の定量的手法を開発しました。
Introduction
エレクトロケミフルミネッセンスイムノアッセイ(ECLIA)は、電気化学的に刺激された際に発光を放出するように設計されたラベルを利用するプロセスに基づいています。これは、基礎産業および学術研究、食品産業、ならびに臨床診断における生物学的分析物の定量的検出のための広く適用可能な技術である1.一般的に、カーボンインク電極を備えた使い捨て可能な96ウェルプレートが使用されます。これらの電極は、免疫測定のための固相担体として機能する。二次抗体は電気化学発光ラベルに結合され、電気がシステムに適用されると、化学ラベルの発光がトリガされます。超低雑音電荷結合装置(CCD)は、捕捉抗体に結合した抗原に直接比例する光強度を記録し、その結果、試料2の標的検体の定量化を行う。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)と比較して、ECLIAは高感度、再現性、ならびにより優れた自動化および一貫性を提供するので有利であると考えられる3。
ここでは、新開発のECLIAシステムを用いて、ヒトおよびマウス由来のサンプルおよび組換えタンパク質の異なる変異体におけるメチルCpG結合タンパク質2(MeCP2)レベルを分析した。MecP2は、メチル化DNA配列と相互作用することが知られているX結合型核酸結合タンパク質である。このタンパク質は、遺伝子発現44,55の調節に関与している。このタンパク質をコードする遺伝子の機能喪失変異は、Tett症候群(RTT)を引き起こす主な原因である、重度の神経発達障害6である。別のMeCP2関連障害、MECP2重複症候群は、RTT 7のものと重なり合う神経学的症状にもつながりる。特に、女性は主にRTTの影響を受け、男性は主にMECP2複製症候群66、77に苦しんでいます。
これらの障害は、中枢神経系(CNS)においてそれぞれ不十分または過剰なMeCP2レベルに関連している。したがって、CNSでMeCP2レベルを増加させるRTTの治療オプションは、MeCP27の過剰に関連する有害な影響を避ける必要があります。この事実により、ECLIAシステムによって提供されるMeCP2タンパク質レベルの高感度かつ正確な定量化は、RTTの進歩とMECP2重複症候群の研究にとって非常に重要です。ヒト細胞株およびマウス組織サンプルからの内因性および外因性MeCP2レベルの正確な測定と、ヒトMeCP2アイソフォームB(アイソフォームe1とも呼ばれる)からなる組換えタンパク質、および血液脳関門8を横断する可能性を有する最小N末端HIV-TAT伝達ドメイン(TAT-MeCP2)が提示される。
Protocol
研究目的での皮膚生検調達の承認は、オーストラリアのウェストミードにある小児病院の人間研究倫理委員会から得られました。動物実験の同意は、オーストリア連邦科学研究経済省から取得され、地元の動物福祉規制に従って実施されました(GZ:66.009/0218-II/3b/2015)。 注: ECLIA システムの原理は図1に示されています。 1. 抗体の選?…
Representative Results
ECLIA システムの原理は図 1に説明されています。図2に、2 つの MeCP2 バリアントの標準曲線を示します。幅広い濃度(1-1,800 ng/mL)で正確な定量が可能でした。図3では、マウス脳およびHDFに由来するライセートのMeCP2レベルを分析した。図3Aでは、ヘテロ接合、野生型およびノックアウトマウス由来の脳核ラ?…
Discussion
内因性MeCP2、組換えMeCP2およびTAT-MeCP2レベルを測定するために、96ウェルプレートECLIAが開発されました。MeCP2タンパク質機能の喪失は、現在、治療が症状管理および理学療法に限定されているRTT症候群6につながることが示されている。1つの有望な治療手段は、MeCP2レベルが必要な,濃度12、13、14、15,13まで滴定することがで?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ブリジット・シュトゥルム博士がECLIAの楽器を支えてくれたことにとても感謝しています。
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
Citer Cet Article
Steinkellner, H., Beribisky, A. V., Mausberg, P., Christodoulou, J., Scheiber-Mojdehkar, B., Huber, A., Sarne, V., Laccone, F. An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants. J. Vis. Exp. (159), e61054, doi:10.3791/61054 (2020).