In Situ Chemotaxis Assay at undersøge mikrobiel adfærd i akvatiske økosystemer
Summary
Præsenteret her er protokollen for en in situ chemotaxis assay, en nyligt udviklet mikrofluidic enhed, der muliggør undersøgelser af mikrobiel adfærd direkte i miljøet.
Abstract
Mikrobiel adfærd, såsom motilitet og chemotaxis (en celles evne til at ændre dens bevægelse som reaktion på en kemisk gradient), er udbredt på tværs af de bakterielle og arkaeale domæner. Chemotaxis kan resultere i betydelige fordele ved ressourceerhvervelse i heterogene miljøer. Det spiller også en afgørende rolle i symbiotiske interaktioner, sygdom og globale processer, såsom biogeokemisk cykling. De nuværende teknikker begrænser imidlertid chemotaxis-forskningen til laboratoriet og kan ikke let anvendes på området. Præsenteret her er en trin-for-trin protokol for indsættelsen af in situ chemotaxis assay (ISCA), en enhed, der muliggør robust forhør af mikrobielle chemotaxis direkte i det naturlige miljø. ISCA er en mikrofluidisk enhed bestående af et 20 brøndsystem, hvor kemikalier af interesse kan indlæses. Når indsat i vandige miljøer, kemikalier diffuse ud af brøndene, skabe koncentration gradienter, mikrober forstand og reagere på ved at svømme ind i brøndene via chemotaxis. Brøndindholdet kan derefter udtages prøver og bruges til (1) kvantificering af styrken af de chemotactic reaktioner på specifikke forbindelser gennem flow cytometri, (2) isolere og kultur lydhør mikroorganismer, og (3) karakterisere identitet og genomiske potentiale af de responderende populationer gennem molekylære teknikker. ISCA er en fleksibel platform, der kan implementeres i ethvert system med en vandig fase, herunder hav-, ferskvands- og jordmiljøer.
Introduction
Forskellige mikroorganismer bruger motilitet og chemotaxis til at udnytte spredte næringsstof miljøer, finde værter, eller undgå skadelige betingelser1,,2,3. Denne mikrobielle adfærd kan igen påvirke satserne for kemisk transformation4 og fremme symbiotiske partnerskaber på tværs af terrestriske, ferskvands- og marine økosystemer2,5.
Chemotaxis er blevet grundigt undersøgt under laboratorieforhold i de sidste 60 år6. Den første kvantitative metode til at studere chemotaxis, kapillær analyse, indebærer en kapillær rør fyldt med en formodede kemoattractant nedsænket i en suspension af bakterier6. Diffusion af kemikaliet ud af røret skaber en kemisk gradient, og chemotactic bakterier reagerer på denne gradient ved at migrere ind i røret7. Siden udviklingen af kapillær analyse, der stadig anvendes i vid udstrækning i dag, er der udviklet mange andre teknikker til at studere chemotaxis under stadig mere kontrollerede fysiske/kemiske forhold, hvor den seneste involverer anvendelse af mikrofluidics8,9,10.
Microfluidics, sammen med højhastighedsvideomikroskopi, gør det muligt at spore adfærden af enkelte celler som reaktion på omhyggeligt kontrollerede gradienter. Selv om disse teknikker har væsentligt forbedret vores forståelse af chemotaxis, har de været begrænset til laboratoriebrug og ikke oversætte let til felt implementering i miljøsystemer. Som følge heraf er bakteriernes evne til at anvende chemotaxis i naturlige økosystemer ikke blevet undersøgt. således er den nuværende forståelse af den potentielle økologiske betydning af chemotaxis forudindtaget mod kunstige laboratorieforhold og et begrænset antal laboratorie-dyrkede bakterielle isolater. Den nyligt udviklede ISCA overvinder disse begrænsninger11.
ISCA bygger på det generelle princip i kapillær analysen; men det gør brug af moderne mikrofabrikation teknikker til at levere en meget replikeret, let deployerbare eksperimentelle platform til kvantificering af chemotaxis mod forbindelser af interesse i det naturlige miljø. Det giver også mulighed for identifikation og karakterisering af chemotactic mikroorganismer ved direkte isolation eller molekylære teknikker. Mens den første arbejdsenhed var selvfabrikeret og konstrueret af glas og PDMS11, den nyeste sprøjtestøbt version er sammensat af polycarbonat, ved hjælp af en meget standardiseret fabrikation procedure (for interesse i den nyeste version af enheden, de tilsvarende forfattere kan kontaktes).
ISCA er kreditkortstørrelse og består af 20 brønde fordelt i et 5 x 4 brøndsystem, der hver især er forbundet med det eksterne vandmiljø ved en lille port (800 μm i diameter; Figur 1). Formodede chemoattractants læsset ind i brøndene diffuse i miljøet via havnen, og chemotactic mikrober reagere ved at svømme gennem havnen i brønden. Da mange faktorer kan påvirke resultatet af et ISCA-eksperiment i det naturlige miljø, vil denne trinvise protokol hjælpe nye brugere med at overvinde potentielle forhindringer og lette effektive implementeringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
På omfanget af akvatiske mikroorganismer er miljøet langt fra homogent og er ofte karakteriseret ved fysiske/kemiske gradienter, der strukturerer mikrobiellesamfund 1,,15. Motile mikroorganismers evne til at bruge adfærd (dvs. chemotaxis) gør det lettere at fouragere inden for disse heterogene mikromiljøer1. Undersøgelse af chemotaxis direkte i miljøet har potentiale til at identificere vigtige interspecifik interaktioner og kemiske…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev finansieret delvist af Gordon og Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, gennem tilskud GBMF3801 til JRS og RS, og en Investigator Award (GBMF3783) til RS, samt en australsk Research Council Fellowship (DE160100636) til J.B.R., en pris fra Simons Foundation til B.S.L. (594111), og et tilskud fra Simons Foundation (542395) til R.S. som en del af principperne for mikrobielle økosystemer (PriME) Collaborative.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
