जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में माइक्रोबियल व्यवहार की जांच करने के लिए सीटू केमोटैक्सिस परख में
Summary
यहां प्रस्तुत एक सीटू केमोटैक्सिस परख के लिए प्रोटोकॉल है, जो हाल ही में विकसित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस है जो पर्यावरण में सीधे माइक्रोबियल व्यवहार के अध्ययन को सक्षम बनाता है।
Abstract
माइक्रोबियल व्यवहार, जैसे गतिशीलता और केमोटैक्सिस (रासायनिक ढाल के जवाब में अपने आंदोलन को बदलने के लिए सेल की क्षमता), बैक्टीरियल और आर्कियल डोमेन में व्यापक हैं। केमोटैक्सिस के परिणामस्वरूप विषम वातावरण में पर्याप्त संसाधन अधिग्रहण लाभ हो सकते हैं। यह सहजीवी बातचीत, रोग और वैश्विक प्रक्रियाओं, जैसे बायोजियोकेमिकल साइकिलिंग में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, वर्तमान तकनीकों प्रयोगशाला के लिए केमोटैक्सिस अनुसंधान को प्रतिबंधित और क्षेत्र में आसानी से लागू नहीं कर रहे हैं । यहां प्रस्तुत एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल है, जो सीटू केमोटैक्सिस परख (आईएससीए) की तैनाती के लिए है, एक ऐसा उपकरण जो प्राकृतिक वातावरण में सीधे माइक्रोबियल केमोटैक्सिस की मजबूत पूछताछ को सक्षम बनाता है। आईएससीए एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस है जिसमें 20 वेल सरणी होती है, जिसमें ब्याज के रसायनों को लोड किया जा सकता है । एक बार जलीय वातावरण में तैनात होने के बाद, रसायन कुओं से बाहर निकलते हैं, एकाग्रता ढाल बनाते हैं जो रोगाणुओं की भावना रखते हैं और केमोटैक्सिस के माध्यम से कुओं में तैराकी करके जवाब देते हैं। अच्छी सामग्री का नमूना लिया जा सकता है और इसका उपयोग (1) प्रवाह साइटोमेट्री, (2) अलग-थलग और संस्कृति उत्तरदायी सूक्ष्मजीवों के माध्यम से विशिष्ट यौगिकों के लिए केमोटेक्टिक प्रतिक्रियाओं की ताकत को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, और (3) आणविक तकनीकों के माध्यम से प्रतिक्रिया देने वाली आबादी की पहचान और जीनोमिक क्षमता की विशेषता है। आईएससीए एक लचीला मंच है जिसे किसी भी प्रणाली में जलीय चरण के साथ तैनात किया जा सकता है, जिसमें समुद्री, मीठे पानी और मिट्टी के वातावरण शामिल हैं।
Introduction
विविध सूक्ष्मजीव बद पोषक तत्वों के वातावरण का दोहन करने, मेजबान खोजने या हानिकारक परिस्थितियों से बचने के लिए गतिशीलता और केमोटैक्सिस का उपयोग करते हैं1,,2,,3। ये माइक्रोबियल व्यवहार बदले में रासायनिक परिवर्तन4 की दरों को प्रभावित कर सकते हैं और स्थलीय, मीठे पानी और समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों2, 5,5में सहजीवी भागीदारी को बढ़ावा देते हैं।
पिछले 60 वर्षों से प्रयोगशाला स्थितियों के अंतर्गत चेमोटैक्सिस का व्यापक अध्ययन कियागयाहै . केमोटैक्सिस का अध्ययन करने के लिए पहली मात्रात्मक विधि, केशिका परख, बैक्टीरिया6के निलंबन में डूबे ख्यात केमोएट्रेक्ट से भरी एक केशिका ट्यूब शामिल है। ट्यूब से बाहर रसायन का प्रसार एक रासायनिक ढाल बनाता है, और केमोटेक्टिक बैक्टीरिया ट्यूब7में माइग्रेट करके इस ढाल का जवाब देते हैं। केशिका परख के विकास के बाद से, आज भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, कई अन्य तकनीकों को तेजी से नियंत्रित भौतिक/रासायनिक स्थितियों के तहत कीमोटैक्सिस का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, जिसमें सबसे हाल ही में माइक्रोफ्लुइडिक्स8,,9,,10का उपयोग शामिल है।
माइक्रोफ्लुइडिक्स, हाई-स्पीड वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ, ध्यान से नियंत्रित ढाल के जवाब में एकल कोशिकाओं के व्यवहार को ट्रैक करने में सक्षम बनाता है। हालांकि इन तकनीकों काफी chemotaxis के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है, वे प्रयोगशाला के उपयोग के लिए प्रतिबंधित किया गया है और पर्यावरण प्रणालियों में क्षेत्र तैनाती के लिए आसानी से अनुवाद नहीं है । नतीजतन, प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों के भीतर केमोटैक्सिस का उपयोग करने के लिए बैक्टीरिया के प्राकृतिक समुदायों की क्षमता की जांच नहीं की गई है; इस प्रकार, केमोटैक्सिस के संभावित पारिस्थितिक महत्व की वर्तमान समझ कृत्रिम प्रयोगशाला स्थितियों और प्रयोगशाला-सुसंस्कृत जीवाणु आइसोलेशन की सीमित संख्या की ओर पक्षपातपूर्ण है। हाल ही में विकसित आईएससीए इन सीमाओं को पार करता है11.
आईएससीए केशिका परख के सामान्य सिद्धांत पर बनाता है; हालांकि, यह प्राकृतिक पर्यावरण में रुचि के यौगिकों की ओर केमोटैक्सिस के मात्राकरण के लिए एक अत्यधिक दोहराया, आसानी से तैनात करने योग्य प्रयोगात्मक मंच देने के लिए आधुनिक माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों का उपयोग करता है। यह प्रत्यक्ष अलगाव या आणविक तकनीकों द्वारा केमोटेक्टिक सूक्ष्मजीवों की पहचान और लक्षण वर्णन की भी अनुमति देता है। जबकि पहला काम करने वाला उपकरण स्वयं-निर्मित और ग्लास और पीडीएमएस11का निर्माण किया गया था, नवीनतम इंजेक्शन-ढाला संस्करण पॉली कार्बोनेट से बना है, एक उच्च मानकीकृत निर्माण प्रक्रिया का उपयोग करके (डिवाइस के नवीनतम संस्करण में रुचि के लिए, संबंधित लेखकों से संपर्क किया जा सकता है)।
आईएससीए क्रेडिट कार्ड के आकार का है और इसमें 5 x 4 अच्छी तरह से सरणी में वितरित 20 कुओं के होते हैं, प्रत्येक एक छोटे बंदरगाह (व्यास में 800 माइक्रोन) द्वारा बाहरी जलीय पर्यावरण से जुड़े होते हैं; चित्रा 1)। कुओं में भरे ख्यात केमोएट्रेक्ट्स बंदरगाह के माध्यम से पर्यावरण में फैलते हैं, और केमोटैक्टिक रोगाणु बंदरगाह के माध्यम से अच्छी तरह से तैराकी करके प्रतिक्रिया करते हैं। चूंकि कई कारक प्राकृतिक वातावरण में आईएससीए प्रयोग के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, इस कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल नए उपयोगकर्ताओं को संभावित बाधाओं को दूर करने और प्रभावी तैनाती की सुविधा प्रदान करने में मदद करेगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
जलीय सूक्ष्मजीवों के पैमाने पर, पर्यावरण समरूप से दूर है और अक्सर भौतिक/रासायनिक ढाल की विशेषता है जो माइक्रोबियल समुदायों की संरचना1,,15। व्यवहार (यानी कीमोटैक्सिस) का उपयोग करने ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन मरीन माइक्रोबायोलॉजी इनिशिएटिव द्वारा जेआर और आरएस को अनुदान GBMF3801 के माध्यम से, और आरएस को एक अन्वेषक पुरस्कार (GBMF3783) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, साथ ही एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद फैलोशिप (DE160100636) J.B.R. के लिए, सिमंस फाउंडेशन से B.S.L. (५९४१११) के लिए एक पुरस्कार, और सिमंस फाउंडेशन (५४२३९५) से एक अनुदान माइक्रोबियल पारिस्थितिकी प्रणालियों (PriME) सहयोगात्मक के सिद्धांतों के भाग के रूप में आर एस ।
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
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