В Situ Chemotaxis анализ для изучения микробного поведения в водных экосистемах
Summary
Здесь представлен протокол анализа химиотерапии на месте, недавно разработанного микрофлюидного устройства, позволяющего проводить исследования микробного поведения непосредственно в окружающей среде.
Abstract
Микробное поведение, такое как подвижность и хемотаксис (способность клетки изменять свое движение в ответ на химический градиент), широко распространены в бактериальных и археологических областях. Хемотаксис может привести к значительным преимуществам приобретения ресурсов в неоднородных средах. Он также играет решающую роль в симбиотических взаимодействиях, болезнях и глобальных процессах, таких как биогеохимическое велоспорт. Тем не менее, современные методы ограничивают исследования хемотаксиса в лаборатории и не легко применимы в этой области. Здесь представлен пошаговая протокола для развертывания на месте химиотаксиса (ISCA), устройства, которое позволяет проводить надежные допросы микробных хемотаксисов непосредственно в естественной среде. ISCA представляет собой микрофлюидное устройство, состоящее из массива из 20 колодец, в котором могут быть загружены химические вещества, представляющие интерес. После развертывания в aqueous средах, химические вещества рассеиваются из скважин, создавая концентрационные градиенты, что микробы смысле и реагировать на плавание в скважины через хемотаксис. Содержимое хорошо может быть отобрано и использовано для (1) количественной силы хемотаксических реакций на конкретные соединения через цитометрию потока, (2) изолят и культуру отзывчивых микроорганизмов, и (3) характеризуют идентичность и геномный потенциал ответивших популяций с помощью молекулярных методов. ISCA является гибкой платформой, которая может быть развернута в любой системе с водной фазой, включая морскую, пресноводную и почву.
Introduction
Разнообразные микроорганизмы используют подвижность и хемотаксис для использования неоднородных питательных сред, найти хозяев или избежать вредныхусловий 1,,2,,3. Такое микробное поведение, в свою очередь, может влиять натемпы химической трансформации 4 и способствовать симбиотическим партнерствам между наземными, пресноводнымии морскими экосистемами 2,,5.
Хемотаксис был широко изучен в лабораторных условиях в течение последних 60 лет6. Первый количественный метод для изучения хемотаксиса, капиллярный анализ, включает в себя капиллярную трубку, наполненную осязаемым хемоаттракантом, погруженным в суспензиюбактерий 6. Диффузия химического вещества из трубки создает химический градиент, и хемотаксических бактерий реагировать на этот градиент, мигрируя втрубку 7. С момента развития капиллярного анализа, по-прежнему широко используется сегодня, многие другие методы были разработаны для изучения хемотаксиса под все более контролируемых физических / химических условиях, с последними с использованиеммикрофлюиды 8,9,10.
Микрофлюиды, наряду с высокоскоростной видео микроскопией, позволяют отслеживать поведение одиночных клеток в ответ на тщательно контролируемые градиенты. Хотя эти методы значительно улучшили наше понимание хемотаксиса, они были ограничены лабораторным использованием и не легко переводятся на развертывание на местах в экологических системах. Вследствие этого не изучена способность естественных сообществ бактерий использовать хемотаксис в естественных экосистемах; таким образом, нынешнее понимание потенциальной экологической важности хемотаксиса пристрастно к искусственным лабораторным условиям и ограниченному числу лабораторно-культурных бактериальных изолятов. Недавно разработанный ISCA преодолевает эти ограничения11.
ISCA основывается на общем принципе анализа капилляров; однако, он использует современные методы микрофабрики для доставки высоко реплицируемой, легко развертываемой экспериментальной платформы для количественной оценки хемотаксиса по отношению к соединениям, представляющим интерес в природной среде. Он также позволяет идентифицировать и идентифицировать хемотаксических микроорганизмов путем прямой изоляции или молекулярных методов. В то время как первое рабочее устройство было самофабрикатом и построено из стекла и PDMS11,последняя инъекционная версия состоит из поликарбоната, используя высокостандартизированную процедуру изготовления (для интереса к последней версии устройства, с соответствующими авторами можно связаться).
ISCA размером с кредитную карту состоит из 20 скважин, распределенных в массиве скважин 5 х 4, каждая из которых связана с внешней водной средой небольшим портом (800 мкм в диаметре; Рисунок 1). Если химиотерапия загружается в скважины, диффузные в окружающую среду через порт, и хемотатические микробы реагируют, плавая через порт в колодец. Поскольку многие факторы могут повлиять на результаты эксперимента ISCA в естественной среде, этот пошаговой протокол поможет новым пользователям преодолеть потенциальные препятствия и облегчить эффективное развертывание.
Protocol
Representative Results
Discussion
В масштабе водных микроорганизмов окружающая среда далека от однородной и часто характеризуется физическими/химическими градиентами, которые структурироватьмикробные сообщества 1,15. Способность разношерстных микроорганизмов использовать поведение (…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично профинансировано Гордон и Бетти Мур Фонд морской микробиологии инициативы, через грант GBMF3801 ДЛЯ JRS и Р.С., и следователь премии (GBMF3783) для Р.С., а также стипендию Австралийского исследовательского совета (DE160100636) J.B.R., награду от Фонда Саймонс до B.S.L. (594111) и грант Фонда Симонс (542395) Р.С. в рамках Принципов микробных экосистем (PriME) Сотрудничество.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
