Sucul Ekosistemlerde Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Situ Chemotaxis Tsay'da
Summary
Burada sunulan bir in situ kemotaksis test için protokol, çevrede doğrudan mikrobiyal davranış çalışmaları sağlayan yeni geliştirilen mikroakışkan bir cihaz.
Abstract
Motilite ve kemotaksis (bir hücrenin kimyasal bir degradeye yanıt olarak hareketini değiştirme yeteneği) gibi mikrobiyal davranışlar bakteriyel ve arke-dizilme deresi arasında yaygındır. Kemotaksiler heterojen ortamlarda önemli kaynak edinimi avantajlarına neden olabilir. Ayrıca biyojeokimyasal bisiklet gibi simbiyotik etkileşimler, hastalık ve küresel süreçlerde de önemli bir rol oynar. Ancak, mevcut teknikler laboratuvariçin kemotaksis araştırma kısıtlamak ve alanında kolayca uygulanabilir değildir. Burada sunulan in situ chemotaxis test (ISCA), doğrudan doğal ortamda mikrobiyal kemotaksilerin sağlam sorgulama sağlayan bir cihaz dağıtım için adım adım protokoldür. ISCA, 20 kuyu dizisinden oluşan ve ilgi çekici kimyasalların yüklenebileceği bir mikroakışkan cihazdır. Sulu ortamlarda konuşlandırıldıktan sonra kimyasallar kuyulardan dışarı yayılır ve mikropların hissedip tepki verdiği konsantrasyon degradeleri oluşturur. Kuyu içeriği daha sonra örneklenebilir ve kullanılabilir (1) akış sitometri yoluyla belirli bileşiklere kemotaktik yanıtların gücünü ölçmek için, (2) izole ve kültür duyarlı mikroorganizmalar, ve (3) moleküler teknikler yoluyla yanıt veren popülasyonların kimlik ve genomik potansiyelini karakterize. ISCA, deniz, tatlı su ve toprak ortamları da dahil olmak üzere sulu faza sahip her sistemde konuşlandırılabilen esnek bir platformdur.
Introduction
Çeşitli mikroorganizmalar yamalı besin ortamları yararlanmak için hareketlilik ve kemotaksiler kullanın, konakları bulmak, ya da zararlı koşullarönlemek 1,2,3. Bu mikrobiyal davranışlar sırayla kimyasal dönüşüm oranlarını etkileyebilir4 ve karasal genelinde simbiyotik ortaklıklar teşvik, tatlı su, ve deniz ekosistemleri2,5.
Kemotaksis kapsamlı son 60 yıldır laboratuvar koşulları altında incelenmiştir6. Kemotaksis çalışma için ilk kantitatif yöntem, kılcal dosdoğru, bir putatif kemoattractant bakteri bir süspansiyon batırılmış dolu bir kılcal tüp içerir6. Tüpün dışarı kimyasal difüzyon bir kimyasal gradyan oluşturur, ve kemotaktik bakteriler tüp içine göç ederek bu degrade yanıt7. Kılcal damar tofaş gelişiminden bu yana, hala yaygın olarak bugün kullanılan, birçok diğer teknikler giderek kontrol fiziksel / kimyasal koşullar altında kemotaksis çalışma geliştirilmiştir, en son mikroakışkanların kullanımını içeren8,9,10.
Mikroakışkanlar, yüksek hızlı video mikroskobu ile birlikte, dikkatle kontrol edilen degradelere yanıt olarak tek hücrelerin davranışlarının izlenmesini sağlar. Bu teknikler kemotaksis anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiş olsa da, laboratuvar kullanımıyla sınırlandırılmıştır ve çevre sistemlerinde saha dağıtımına kolayca çevrilmemektedir. Sonuç olarak, doğal bakteri topluluklarının doğal ekosistemler içinde kemotaksis kullanma kapasitesi incelenmemiştir; bu nedenle, kemotaksisin potansiyel ekolojik önemine yönelik mevcut anlayış yapay laboratuvar koşullarına ve sınırlı sayıda laboratuvar kültürlü bakteri izoleedilmesine yöneliktir. Son zamanlarda geliştirilen ISCA bu sınırlamalar11üstesinden .
ISCA kılcal damar tözünün genel prensibine dayanmaktadır; ancak, doğal ortamda ilgi bileşikleri doğru kemotaksis nicelleştirilmesi için son derece çoğaltılmış, kolayca dağıtılabilir deneysel platform sunmak için modern mikroüretim teknikleri kullanır. Ayrıca kemotaktik mikroorganizmaların doğrudan izolasyon veya moleküler tekniklerle tanımlanmasını ve karakterizasyonunu sağlar. İlk çalışma cihazı kendi kendine imal edilmiş ve cam ve PDMS11inşa edilmiş iken, en son enjeksiyon kalıplı versiyonu polikarbonat oluşur, son derece standart üretim prosedürü kullanarak (cihazın en son sürümü ilgi için, ilgili yazarlar temasa geçilebilir).
ISCA kredi kartı büyüklüğündedir ve her biri dış su ortamına küçük bir bağlantı noktası (800 μm çapında) ile bağlanan 5 x 4 kuyu halinde dağıtılan 20 kuyudan oluşur; Şekil 1). Kuyulara yüklenen putatif kemoattractants liman üzerinden çevreye yayılır ve kemotaktik mikroplar limandan kuyuya yüzerek tepki verir. Doğal ortamdaki bir ISCA deneyinin sonucunu etkileyen birçok faktör olduğundan, bu adım adım protokol yeni kullanıcıların olası engelleri aşmasına ve etkili dağıtımları kolaylaştırmasına yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sucul mikroorganizmaların ölçeğinde, çevre homojen olmaktan uzaktır ve genellikle mikrobiyal toplulukları1,15yapı fiziksel / kimyasal degradeler ile karakterizedir.15 Hareketli mikroorganizmaların davranış kullanma kapasitesi (yani kemotaksis) bu heterojen mikroortamlarda avlanmayı kolaylaştırır1. Chemotaksilerin doğrudan çevrede incelenmesi, önemli interspesifik etkileşimleri ve kimyasal tercihleri belirleme potansiyeli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma kısmen Gordon ve Betty Moore Vakfı Deniz Mikrobiyolojisi Girişimi tarafından, J.R.S. ve R.S.’ye GBMF3801 ve R.S.’ye bir Araştırmacı Ödülü (GBMF3783) aracılığıyla finanse edilmiştir. yanı sıra Avustralya Araştırma Konseyi Bursu (DE160100636) J.B.R., Simons Vakfı’ndan B.S.L.’ye (594111) bir ödül ve Mikrobiyal Ekosistemler İlkeleri (PriME) İşbirliğinin bir parçası olarak Simons Vakfı’ndan (542395) R.S.’ye hibe.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
