We beschrijven een protocol voor een driedimensionaal co-cultuurmodel van geïnfecteerde luchtwegen, met CFBE41o– cellen, THP-1 macrofagen en Pseudomonas aeruginosa, gevestigd op de lucht-vloeibare interface. Dit model biedt een nieuw platform om tegelijkertijd de werkzaamheid van antibiotica, epitheelbarrièrefunctie en ontstekingsmarkers te testen.
fDrug onderzoek voor de behandeling van longinfecties vordert naar voorspellende in vitro modellen van hoge complexiteit. De veelzijdige aanwezigheid van bacteriën in longmodellen kan de epitheliale opstelling opnieuw aanpassen, terwijl immuuncellen een ontstekingsreactie tegen de bacteriën in de microomgeving coördineren. Hoewel in vivo modellen de keuze zijn geweest voor het testen van nieuwe anti-infectiemiddelen in de context van cystische fibrose, bootsen ze nog steeds niet nauwkeurig de in vivo omstandigheden van dergelijke ziekten bij de mens en de behandelingsresultaten na. Complexe in vitro modellen van de geïnfecteerde luchtwegen op basis van menselijke cellen (bronchiale epitheel en macrofagen) en relevante ziekteverwekkers kunnen deze kloof overbruggen en de vertaling van nieuwe anti-infectiemiddelen in de kliniek vergemakkelijken. Voor dergelijke doeleinden is een co-cultuurmodel van de menselijke cystische fibrose bronchiale epitheelcellijn CFBE41o– en THP-1 monocyten-afgeleide macrofagen vastgesteld, die een infectie van het menselijk bronchiale slijmvlies nabootsen door P. aeruginosa bij lucht-vloeibare interface (ALI) voorwaarden. Dit model is opgezet in zeven dagen, en de volgende parameters worden tegelijkertijd beoordeeld: epitheelbarrière integriteit, macrofaag transmigratie, bacteriële overleving, en ontsteking. Het huidige protocol beschrijft een robuust en reproduceerbaar systeem voor het evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen en reacties die relevant kunnen zijn voor het ontdekken van nieuwe anti-infectiemiddelen en het optimaliseren van hun aerosol levering aan de longen.
Pseudomonas aeruginosa is een relevante ziekteverwekker bij cystische fibrose (CF) die bijdraagt aan longweefselstoornissen1. De productie van polysaccharides, zoals alginaat en andere mucoid exopolysadiaden, coördineert de voortgang van de ziekte, wat leidt tot hardnekkige bacteriële therapietrouw, beperkt de levering van antibiotica aan bacteriën en beschermt de bacteriën tegen het immuunsysteem van de gastheer2. De overgang van P. aeruginosa van het planktonische stadium naar biofilmvorming is in deze context een kritiek punt, waardoor ook het optreden van antibioticatolerantie wordt vergemakkelijkt.
In het kader van CF is de muis voornamelijk als model gebruikt. Muizen ontwikkelen deze ziekte echter niet spontaan met de introductie van CF-mutaties3. De meeste van de bacteriële biofilm ontwikkeling en drug gevoeligheid studies zijn uitgevoerd op abiotische oppervlakken, zoals petrischaaltjes. Deze benadering vertegenwoordigt echter niet de complexiteit in vivo. Zo ontbreken belangrijke biologische barrières, waaronder immuuncellen en het mucosale epitheel. Hoewel P. aeruginosa is vrij giftig voor epitheliale cellen, sommige groepen zijn erin geslaagd om co-cultiveren een eerdere P. aeruginosa biofilm met menselijke bronchiale cellen. Deze cellen zijn afkomstig van patiënten met cystische fibrose met CFTR-mutatie (CFBE41o– cellen)4 en konden de werkzaamheid van antibioticabeoordelen 5 of de correctie van het CFTR-eiwit tijdens infectie beoordelen6. Een dergelijk model bleek de voorspelbaarheid van de werkzaamheid van geneesmiddelen te verbeteren, naast het mogelijk maken van karakterisering van problemen met geneesmiddelen die faalden in latere fasen van de ontwikkeling van geneesmiddelen7.
Echter, in de long, het mucosale epitheel wordt blootgesteld aan lucht. Bovendien spelen immuuncellen die in de luchtwegen aanwezig zijn, zoals weefselmacrofagen, een essentiële rol tegen ingeademde ziekteverwekkers of deeltjes8. Macrofagen migreren door de verschillende cellagen om het bronchiale lumen te bereiken en de infectie te bestrijden. Bovendien hebben ingeademde geneesmiddelen ook te maken met de aanwezigheid van slijm als een extra niet-cellulair element van de longluchtbloedbarrière9. Er zijn inderdaad verschillende complexe driedimensionale (3D) in vitro modellen ontwikkeld, gericht op het vergroten van de in vivo relevantie. Co-cultuur systemen verhogen niet alleen de complexiteit van in vitro systemen voor het ontdekken van geneesmiddelen, maar ook in staat om celcelinteracties te bestuderen. Deze complexiteit is aangepakt in studies over macrofaagmigratie10, het vrijkomen van antimicrobiële peptiden door neutrofielen11, de rol van slijm bij infectie9, en de epitheelcelreactie op overmatige schade12. Echter, een betrouwbare CF-geïnfecteerde in vitro model dat de genetische mutatie in CF functies, dat wordt blootgesteld aan de lucht (verhoogde fysiologische aandoening), en integreert immuuncellen ontbreekt nog steeds.
Om deze kloof te overbruggen, beschrijven we een protocol voor stabiele menselijke 3D co-cultuur van de geïnfecteerde luchtwegen. Het model bestaat uit menselijke CF bronchiale epitheelcellen en macrofagen, besmet met P. aeruginosa en in staat om zowel een diffusional als immunologische barrière te vertegenwoordigen. Met het doel om anti-infectieve stoffen te testen bij een redelijk hoge doorvoer, werd deze co-cultuur vastgesteld op het doorlatende filtermembraan van putplaatinserts, met behulp van twee menselijke cellijnen: CFBE41o– en THP-1 monocyten-afgeleide macrofagen. Bovendien, om uiteindelijk de depositie van aerosolized anti-infectives13te bestuderen, werd het model gevestigd op de lucht-vloeibare interface (ALI) in plaats van vloeibare bedekte omstandigheden (LCC).
Zoals we hier rapporteren, maakt dit model het mogelijk om niet alleen bacteriële overleving bij een behandeling met antibiotica te beoordelen, maar ook celcytotoxiciteit, epitheliale barrière-integriteit, macrofaagtransmigratie en ontstekingsreacties, die essentiële parameters zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Dit protocol combineert twee relevante celtypen voor inademingstherapie van de longluchtwegen: macrofagen en CF bronchiale epitheel. Deze cellen zijn gezaaid aan weerszijden van doorlatende steun inserts, waardoor cel blootstelling aan lucht (de zogenaamde lucht-vloeistof interface (ALI) voorwaarden). Deze co-cultuur van gastheercellen wordt vervolgens besmet met P. aeruginosa. Beide gastheercellijnen zijn van menselijke oorsprong: de epitheelcellen vertegenwoordigen het cystische fibrose bronchiale epitheel, met een mutatie op het CF-kanaal (CFBE41o–) en de THP-114 cellen zijn een goed gekarakteriseerde macrofaag-achtige cellijn. Een confluent epitheellaag mag zich eerst vormen aan de bovenzijde van putplaatwisselplaten voordat de macrofaagachtige cellen aan het tegenovergestelde compartiment worden toegevoegd. Zodra de co-cultuur is gevestigd op ALI, wordt het systeem ingeënt met P. aeruginosa aan de apicale kant. Dit geïnfecteerde co-cultuursysteem wordt vervolgens gebruikt om de werkzaamheid van een antibioticum te beoordelen, bijvoorbeeld tobramycine. De volgende eindpunten worden geanalyseerd: epitheelbarrière-integriteit in termen van transepitheliale elektrische resistentie (TEER), visualisatie van celcel- en celbacteriëninteracties door confocale laserscansmicroscopie (CLSM), bacteriële overleving door het tellen van kolonievormende eenheden (CFU), overleving van gastheercellen (cytotoxiciteit) en cytokine-release.
Dit document beschrijft een protocol voor een 3D co-cultuur van de geïnfecteerde luchtwegen, gevormd door de menselijke cystische fibrose bronchiale epitheelcellijn CFBE41o- en de menselijke monocyten-afgeleide macrofaag cellijn THP-1. Het protocol maakt de beoordeling van epitheliale barrière integriteit, macrofaag transmigratie, bacteriën overleving, en ontsteking, die belangrijke parameters bij het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen en gastheer-reacties tegelijkertijd. De nieuwigheid in het model ligt in…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk ontving financiering van het HORIZON 2020-programma van de Europese Unie voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie in het kader van subsidieovereenkomst nr. Wij danken Dr. Ana Costa en Dr. Jenny Juntke voor de grote steun aan de ontwikkeling van de co-cultuur, Olga Hartwig, voor de wetenschappelijke illustratie, Anja Honecker, voor ELISA-tests, Petra König, Jana Westhues en Dr. Chiara De Rossi voor de ondersteuning van celcultuur, analyse en microscopie. We danken Ook Chelsea Thorn voor het nalezen van ons manuscript.
Accutase | Accutase | AT104 | |
Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | – | |
CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
CFBE41o– cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
Petri dishes | Greiner | 664102 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |