Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von erwachsenen Maus- und Rattenkardiomyozyten vor.
Abstract
Die Ex-vivo-Kultur der adulten Säugetierkardiomyozyten (CMs) stellt das relevanteste experimentelle System für die In-vitro-Studie der Herzbiologie dar. Adult mammalian CMs sind endlos differenzierte Zellen mit minimaler proliferativer Kapazität. Der post-mitotische Zustand von CMs für Erwachsene schränkt nicht nur die Progression des Kardiomyozytenzellzyklus ein, sondern auch die effiziente Kultur von CMs. Darüber hinaus ist die langfristige Kultur von CMs für Erwachsene für viele Studien notwendig, wie z. B. cm-Proliferation und Analyse der Genexpression.
Die Maus und die Ratte sind die beiden am häufigsten bevorzugten Labortiere, die für die Kardiomyozytenisolation verwendet werden. Während die langfristige Kultur der Ratten-CMs möglich ist, sind erwachsene Maus-CMs todesanfällig und dürfen unter normalen Bedingungen nicht länger als fünf Tage kultiviert werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Zellisolation und das Langzeitkulturprotokoll für erwachsene murine CMs zu optimieren. Mit diesem modifizierten Protokoll ist es möglich, sowohl adulte Maus- als auch Ratten-CMs für mehr als 20 Tage erfolgreich zu isolieren und zu kultiieren. Darüber hinaus ist die siRNA-Transfektionseffizienz isolierter CM im Vergleich zu früheren Berichten deutlich erhöht. Für die CM-Isolierung der Erwachsenenmaus wird die Langendorff-Perfusionsmethode mit einer optimalen Enzymlösung und ausreichend Zeit für eine vollständige extrazelluläre Matrixdissoziation genutzt. Um reine ventrikuläre CMs zu erhalten, wurden beide Vorhöfe seziert und verworfen, bevor die Disassoziation und Beschichtung fortgesetzt wurden. Die Zellen wurden auf einer lamininbeschichteten Platte verteilt, was eine effiziente und schnelle Befestigung ermöglichte. CMs durften sich mit 4-6 h vor der siRNA-Transfektion begnügen. Kulturmedien wurden alle 24 Stunden für 20 Tage aufgefrischt, und anschließend wurden CMs für herzspezifische Marker wie Troponin und Marker des Zellzyklus wie KI67 fixiert und befleckt.
Introduction
Herzkrankheiten sind eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Fast alle Arten von Herzverletzungen führen zu einem signifikanten Verlust von erwachsenen Kardiomyozyten (CMs). Erwachsene Säugetierherzen sind nicht in der Lage, ihre Herzverletzung aufgrund der seneszenten Natur des erwachsenen CM1zu reparieren. So führt jede Beleidigung des erwachsenen Säugetierherzens zu einem dauerhaften Verlust von CMs, was zu einer verminderten Herzfunktion und Herzinsuffizienz führt. Im Gegensatz zu erwachsenen Säugetieren können kleine Tiere wie Zebrafische und Newtika ihre Herzverletzungen durch bestehende CM-Proliferation2,3,4regenerieren. Weltweit wird derzeit versucht, eine neuartige therapeutische Intervention bei Herzverletzungen sowohl durch proliferative als auch durch nicht-proliferative Ansätze zu finden. In den vergangenen Jahrzehnten wurden verschiedene Arten von genetischen Mausmodellen entwickelt, um Herzverletzungen und Reparaturen zu untersuchen. Die Verwendung von In-vivo-Tiermodellen ist jedoch nach wie vor ein teurer Ansatz mit der zusätzlichen Komplexität, um einen zellautonomen Mechanismus von Sekundäreffekten zu entschlüsseln. Außerdem sind In-vivo-Systeme eine Herausforderung, CM-spezifische Effekte einer pharmakologischen Intervention zu analysieren, die kardioprotektive Signalisierung aus dem CM induziert.
Darüber hinaus ist die langfristige Kultur der CMs für Erwachsene notwendig, um CM-Proliferationsanalysen durchzuführen. CM-Proliferationstests erfordern mindestens 4-5 Tage, damit Zellen in den Zellzyklus induziert werden und danach genaue Daten erhalten. Darüber hinaus sind Studien, die isolierte CMs für elektrophysiologische Studien, Arzneimittelscreening, Toxizitätsstudien und Ca++ Homöostasestudien nutzen, alle eines verbesserten Kultursystems5,6,7erforderlich. Darüber hinaus zeigen neuere Studien die kardioprotektive Bedeutung von Zytokinen, die von CMs (Kardiokinen)8,9abgesondert werden. Um die therapeutische Rolle und den molekularen Mechanismus dieser Kardiokine während der Herzreparatur und Regeneration zu untersuchen, ist eine längere Kultur erforderlich.
Erwachsene Ratten-CMs sind robust genug für einzellige Isolation und Langzeitkultur in einem In-vitro-System10,11,12. Erwachsene Maus-CMs sind jedoch von großem Interesse für In-vitro-Assays, da eine Vielzahl von genetisch veränderten Mausmodellen verfügbar ist, die die Entwicklung und Durchführung verschiedener innovativer Analysen ermöglichen, die mit Ratte CM13nicht möglich sind. Im Gegensatz zur CM-Isolation von erwachsenen Ratten ist es eine ziemliche Herausforderung, eine einzellige Suspension von erwachsenen Mausherzen zu erhalten, und die langfristige Kultur der erwachsenen Maus-CMs in der Kultur ist noch schwieriger.
Adult CM Isolation von Maus- und Rattenherzen mit einem Langendorff-System wurde bereits eingerichtet, um CM-Funktion5,14,15zu studieren. Hier haben wir ausführlich die Protokolle für die CM-Isolierung von Erwachsenen von Ratten und Mäusen sowie eine modifizierte Langzeitkultur, Transfektion und CM-Proliferation isolierter Zellen beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist von entscheidender Bedeutung, ein Protokoll für die Isolierung der Kardiomyozyten und die langfristige Kultur für die Durchführung zellspezifischer mechanistischer Studien zu erstellen. Es gibt nur wenige Berichte über Erwachsene CM Isolation Protokolle, und noch weniger von ihnen werden für die langfristige Kultur von erwachsenen Mäusen CM15,16,17verwendet. Es wird gezeigt, dass die erwachsene Ratte CM eine höhere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel der Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Universität Cincinnati, College of Medicine, an Dr. Onur Kanisicak unterstützt; ein Stipendium der National Institutes of Health (R01HL148598) an Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak wird vom American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117) unterstützt. Dr. Perwez Alam wird von der American Heart Association Postdoktorandenstipendium (AHA_20POST35200267) unterstützt. Dr. Malina J. Ivey wird durch ein NIH T32-Stipendium (HL 125204-06A1) unterstützt.
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
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