Изоляция, трансфекция и долгосрочная культура взрослых мышей и крысиных кардиомиоцитов
Summary
Здесь мы представляем протокол изоляции, трансфекции и долгосрочной культуры взрослых мышей и крыс кардиомиоцитов.
Abstract
Ex vivo культуры взрослых млекопитающих кардиомиоцитов (CMs) представляет собой наиболее релевантную экспериментальную систему для in vitro исследования сердечной биологии. Взрослые млекопитающие СМ являются неизлечимо дифференцированными клетками с минимальной пролиферативной емкостью. Постмитотическое состояние взрослых CMs не только ограничивает прогрессирование цикла сердечно-миоцитов клеток, но и ограничивает эффективную культуру CMs. Кроме того, долгосрочная культура взрослых CMs необходима для многих исследований, таких как распространение СМ и анализ экспрессии генов.
Мышь и крыса являются двумя наиболее предпочтительными лабораторных животных, которые будут использоваться для кардиомиоцитов изоляции. В то время как долгосрочная культура крысЫ CMs возможно, взрослые мыши CMs восприимчивы к смерти и не могут быть культурно более пяти дней в нормальных условиях. Таким образом, существует критическая необходимость оптимизации изоляции клеток и долгосрочного протокола культуры для взрослых murine CMs. С помощью этого измененного протокола, можно успешно изолировать и культуры как взрослых мыши и крысы CMs в течение более 20 дней. Кроме того, эффективность трансфекции siRNA изолированных СМ значительно возросла по сравнению с предыдущими докладами. Для изоляции мышей-мышей метод перфузии Langendorff используется с оптимальным ферментным раствором и достаточным временем для полной внеклеточной диссоциации матрицы. Для того, чтобы получить чистые желудочковые CMs, как atria были вскрыты и отброшены, прежде чем приступить к разъединению и покрытие. Клетки рассеивались на пластине с ламинином покрытием, что позволяло эффективно и быстро вложения. CMs было разрешено согласиться на 4-6 ч до siRNA трансфекции. Культурные средства массовой информации обновлялись каждые 24 ч в течение 20 дней, а затем, CMs были зафиксированы и окрашены для сердечно-специфических маркеров, таких как Troponin и маркеры клеточного цикла, такие как KI67.
Introduction
Сердечные заболевания являются одной из ведущих причин смерти во всем мире. Почти все виды сердечных травм приводят к значительной потере взрослых кардиомиоцитов (СМ). Взрослые сердца млекопитающих не в состоянии восстановить свои сердечные травмы из-за старческого характера взрослого CM1. Таким образом, любое оскорбление сердца взрослого млекопитающего приводит к постоянной потере СМ, что приводит к снижению сердечной функции и сердечной недостаточности. В отличие от взрослых млекопитающих, мелкие животные, как зебрафиш и тритон сердца могут регенерировать свои сердечные травмы через существующиеСМ распространения 2,3,4. Во всем мире продолжаются усилия по поиску нового терапевтического вмешательства в связи с сердечной травмой с помощью как пролиферативных, так и нераспространенных подходов. В последние десятилетия, различные типы генетических моделей мыши были разработаны для изучения сердечной травмы и ремонта. Однако использование моделей животных in vivo по-прежнему является дорогостоящим подходом с дополнительной сложностью для расшифровки клеточно-автономного механизма от вторичных эффектов. Кроме того, in vivo системы являются сложными для анализа CM специфические эффекты фармакологического вмешательства, которое вызывает кардиопротекторной сигнализации от СМ.
Кроме того, для проведения анализа распространения СМ необходима долгосрочная культура взрослых СМ. Анализы распространения СМ требуют как минимум 4-5 дней для индуцированных клеток в клеточный цикл и получения точных данных после этого. Кроме того, исследования, которые используют изолированные CMs для электрофизиологических исследований, скрининга наркотиков, исследования токсичности,и Ca й гомеостаза исследования все нуждаются в улучшенной системекультуры 5,6,7. Кроме того, последние исследования показывают кардиопротекторное значение цитокинов, выделяется из СМ (кардиокинов)8,,9. Для того, чтобы исследовать терапевтическую роль и молекулярный механизм этих кардиокинов во время ремонта и регенерации сердца, необходима длительная культура.
Взрослые крысы CMs являются достаточно надежными для одноклеточной изоляции и долгосрочной культуры в системе in vitro10,11,12. Тем не менее, взрослые мыши CMs имеют большой интерес для in vitro анализы, из-за наличия различных генетически модифицированных моделей мыши, что позволяет для разработки и выполнения различных инновационных анализов, которые невозможны с крысой CM13. В отличие от взрослых крыс CM изоляции, это довольно сложно получить одноклеточную подвеску от взрослых сердца мыши, и долгосрочная культура взрослых мыши CMs в культуре является еще более сложной задачей.
Взрослый CM изоляции от мыши и крысы сердца с помощью системы Langendorff ранее была созданадля изучения функцииCM 5,14,15. Здесь мы подробно описали протоколы изоляции взрослых СМ как от крыс, так и от мышей, а также модифицированную долгосрочную культуру, трансфекцию и распространение СМ изолированных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует критическая необходимость в создании протокола для взрослых кардиомиоцитов изоляции и долгосрочной культуры для выполнения клеточных механистических исследований. Есть только несколько докладов, обсуждающих взрослых ПРОТОКОЛов изоляции CM, и еще меньше из них используют?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансированием от кафедры патологии и лабораторной медицины Университета Цинциннати, Медицинского колледжа, д-ра Онура Канишичака; грант От Национальных институтов здравоохранения (R01HL148598) доктору Онуру Канисаку. Д-р Онур Kanisicak поддерживается Американской ассоциации сердца Карьера развития премии (18CDA34110117). Д-р Perwez Алам поддерживается Американской ассоциации сердца постдокторской грант (AHA_20POST35200267). Д-р Малина Айви поддерживается грантом NIH T32 (HL 125204-06A1).
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
