Isolering, Transfection, och långsiktig kultur av vuxna Mus och Råtta Cardiomyocytes
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering, transfection och långsiktiga kultur av vuxna mus och råtta kardiomyocyter.
Abstract
Ex vivo kultur av de vuxna däggdjur kardiomyocyter (CMs) presenterar den mest relevanta experimentella systemet för in vitro-studien av hjärt biologi. Vuxna däggdjurs-CMs är terminalt differentierade celler med minimal proliferativ kapacitet. Den post-mitotiska tillstånd av vuxna CMs inte bara begränsar kardiomyocyte cell cykel progression men också begränsar den effektiva kulturen av CMs. Dessutom är den långsiktiga kulturen hos vuxna CMs nödvändig för många studier, såsom CM spridning och analys av genuttryck.
Musen och råttan är de två mest föredragna försöksdjur som ska användas för kardiomyocyte isolering. Medan den långsiktiga kulturen av råtta-CMs är möjlig, är vuxna mus-ING mottagliga för döden och kan inte odlas mer än fem dagar under normala förhållanden. Därför finns det ett kritiskt behov av att optimera cellen isolering och långsiktiga kultur-protokollet för vuxna murine CMs. Med detta modifierade protokoll är det möjligt att framgångsrikt isolera och kultur både vuxna mus och råtta CMs i mer än 20 dagar. Dessutom är siRNA transfektion effektivitet isolerade CM betydligt ökat jämfört med tidigare rapporter. För vuxna mus CM isolering, langendorff perfusion metoden utnyttjas med en optimal enzymlösning och tillräcklig tid för fullständig extracellulär matris dissociation. För att erhålla ren Ventrikulärt CMs, var både atria dissekeras och kasseras innan du fortsätter med de disassociation och plätering. Celler var spridda på en laminin belagda plattan, vilket möjliggjed för effektiv och snabb fastsättning. CMs var tillåtet att nöja sig med 4-6 h innan siRNA transfection. Kulturmedia var utvilad var 24 h i 20 dagar, och därefter var CMs fasta och färgade för hjärt-specifika markörer som Troponin och markörer för cellcykel som KI67.
Introduction
Hjärtsjukdomar är en av de vanligaste dödsorsakerna i världen. Nästan alla typer av hjärt skada resultera i en betydande förlust av vuxna kardiomyocyter (CMs). Vuxna däggdjurshjärtan kan inte reparera sin hjärtskada på grund av den vuxna CM1:ssenescentkaraktär . Således, någon förolämpning mot den vuxna däggdjur hjärtat resulterar i en permanent förlust av CMs, vilket leder till minskad hjärtfunktion och hjärtsvikt. Till skillnad från vuxna däggdjur, små djur som zebrafisk och newt hjärtan kan regenerera sin hjärtskada genom befintliga CM spridning2,3,4. En världsomspännande insats pågår för att hitta en ny terapeutisk intervention för hjärtskada via både proliferative och icke-proliferative metoder. Under de senaste decennierna har olika typer av genetiska musmodeller utvecklats för att studera hjärtskada och reparation. Att använda in vivo-djurmodeller fortsätter dock att vara en dyr metod med den ytterligare komplexiteten för att dechiffrera en cell-autonom mekanism från sekundära effekter. Förutom, in vivo system är utmanande att analysera CM specifika effekter av en farmakologisk intervention som inducerar hjärtskyddande signalering från CM.
Dessutom är den långsiktiga kulturen hos vuxna OEM-skivor nödvändig för att utföra CM-spridningsanalyser. CM spridningsanalyser kräver minst 4-5 dagar för att celler ska induceras i cellcykeln och för att få korrekta data efter det. Dessutom, studier som utnyttjar isolerade CMs för elektrofysiologiska studier, drogscreening, toxicitet studier, och Ca+ + homeostas studier är alla i behov av en förbättrad kultur system5,6,7. Vidare visar nyligen genomförda studier den hjärtskyddande betydelsen av cytokiner som utsöndras från CMs (kardiokiner)8,9. För att undersöka den terapeutiska roll och molekylära mekanismen av dessa kardiokiner under hjärtat reparation och regenerering, krävs en långvarig kultur.
Vuxna rat-CMs är robusta nog för encellig isolering och långsiktig kultur i ett in vitro-system10,11,12. Men vuxna mus-CMs är av stort intresse för in vitro-analyser, på grund av tillgången på en mängd olika genetiskt modifierade musmodeller, som möjliggör utformning och utförande av olika innovativa analyser som inte är möjliga med råtta CM13. I kontrast till vuxen råtta CM isolering, den er helt utmanande till få en enkel- cell upphängning från vuxen mus hjärtan, och den lång- tid kultur av vuxen mus CMs i kultur är jämn mer utmanande.
Adult CM isolering från mus och råtta hjärtan med hjälp av en Langendorff system har tidigare inrättats för att studera CM funktion5,14,15. Här har vi beskrivit i detalj protokollen för vuxna CM isolering från både råttor och möss, samt en modifierad långsiktig kultur, transfection, och CM spridning av isolerade celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns ett kritiskt behov av att upprätta ett protokoll för vuxna kardiomyocyte isolering och långsiktig kultur att utföra cell-specifika mekanistiska studier. Det finns bara ett fåtal rapporter diskuterar vuxna CM isolering protokoll, och ännu färre av dem används för långsiktig kultur av vuxna möss CM15,16,17. Det visas att den vuxna råttan CM har en högre tolerans mot in vitro-kulturen än de vuxna mössen CM<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av finansiering från institutionen för patologi och laboratoriemedicin, University of Cincinnati, College of Medicine, till Dr Onur Kanisicak; ett anslag från National Institutes of Health (R01HL148598) till Dr Onur Kanisicak. Dr Onur Kanisicak stöds av American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr Perwez Alam stöds av American Heart Association postdoktoralt bidrag (AHA_20POST35200267). Dr Malina J. Ivey stöds av ett NIH T32-bidrag (HL 125204-06A1).
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
