Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Ce protocole décrit le clonage et l’expansion de lymphocytes T régulateurs humains pour la génération de Treg humains viables de très haute pureté avec une déméthylation stable au niveau de la région déméthylée spécifique des Tregs (TSDR) et des caractéristiques phénotypiques spécifiques des Tregs.
Les lymphocytes T régulateurs humains (Treg) sont notoirement difficiles à isoler avec une grande pureté compte tenu des méthodes actuelles d’enrichissement des Tregs. Ces méthodes sont basées sur l’identification des Treg à l’aide de plusieurs marqueurs de surface cellulaires dépendants de l’activation avec des niveaux d’expression variables dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. Les populations isolées en tant que « Treg » contiennent donc souvent un nombre considérable de cellules effectrices non-Treg (c’est-à-dire Teff) qui entravent la caractérisation phénotypique et fonctionnelle précise de ces cellules, leur caractérisation génomique et protéomique, leur dénombrement fiable dans différents états de santé et de maladie, ainsi que leur isolement et leur expansion à des fins thérapeutiques. Ce dernier, en particulier, reste un obstacle majeur, car l’expansion par inadvertance des cellules effectrices dans les compartiments cellulaires pertinents pour les Treg (par exemple, les lymphocytes T CD4+CD25+ ) peut rendre l’immunothérapie à base de Treg inefficace, voire nocive. Ce travail présente une méthode qui contourne les problèmes associés à l’isolement et à l’expansion des Treg en population et montre que la génération de clones candidats Treg avec la sélection, la culture et l’expansion ultérieures de cellules monoclonales soigneusement vérifiées, permet la génération d’un produit de cellules Treg ultra-pures qui peut être conservé en culture pendant de nombreux mois. permettant l’étude en aval de ces cellules, y compris pour d’éventuelles applications thérapeutiques.
Le but de ce protocole est de permettre la propagation in vitro de Treg humains clonaux de très haute pureté. L’isolement des populations enrichies en Tregs et le clonage ultérieur permettent de sélectionner les phénotypes Tregs souhaités et de les étendre pour une étude plus approfondie de la biologie de ces cellules, l’exploration de leur utilité thérapeutique potentielle et d’autres applications expérimentales en aval.
Le clonage des Treg produira une pureté des Treg nettement supérieure à celle des approches d’isolement et d’expansion polyclonaux. Cela est dû à l’exclusion fiable et contrôlée des cellul....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Ce protocole suit toutes les lignes directrices institutionnelles relatives à la conduite éthique de la recherche impliquant l’utilisation d’échantillons humains. Le travail avec des cellules humaines et d’autres produits sanguins humains doit avoir lieu au moins dans un environnement certifié BSL-2 en suivant au minimum les directives de sécurité BLS-2.
1. Pré-enrichissement des cellules mononucléées du sang périphérique humainpour les cellules HI CD4+CD127loCD25
ATTENTION : Utilisez une technique stérile tout au long du traitement. Jetez immédiate....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
La mise en œuvre réussie de ce protocole conduira à la génération de clones et de lignées de lymphocytes T régulateurs humains stables.
La présélection/pré-enrichissementdes cellules HI CD4+CD127loCD25 était une méthode simple pour obtenir une population de départ contenant la plupart des Treg humains (Figure 1A–C). Tous les clones n’ont pas présenté un phénotype Treg. Le présélection des clones par mesure de l’exp.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Ce protocole décrit la propagation de lymphocytes T régulateurs humains ultrapurs par l’isolement, l’expansion et le contrôle minutieux des cellules obtenues dans une approche de dilution limite et d’expansion basée sur les cellules nourricières à partir de populations de départ contenant des Tregs.
Les étapes critiques de cette approche sont les suivantes : 1) le choix d’une population de départ appropriée. En général, le compartiment CD127loCD25
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce projet a été soutenu par le National Eye Institute des National Institutes of Health sous le numéro de prix K08EY025324 (Nowatzky) et par une bourse Colton Scholar du Judith and Stewart Colton Center for Autoimmunity (Nowatzky).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,22 et micro ; m Stericup, 500 mL | Millipore | 5500 | Stockage et préparation des milieux |
| 100x acides aminés non essentiels | Gibco | 11140-050 | Composant du milieu |
| 15 mL Tubes à centrifuger coniques (50/sac, caisse de 500) | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | Composant du milieu |
| 25 ml Bassin de pipette à puits unique | Fischer Scientific | 13-681-508 | |
| Tube à centrifuger conique de 50 mL (25/manchon) | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50x Pénicilline Streptomycine Soln | Corning | Corning, 30-001-Cl | Composant de média |
| CryoTube Vial Int Thread Round Btm Starfoot PP Bouchon à vis Stérile PP 1,8 mL | Nalge Nunc | 377267 | |
| DMSO | Corning | 25-950-CQC | |
| Kit de sélection positive EasySep Human CD25 | Stemcell Technologies | 18231 | Les alternatives sont le tri sur colonne FACS ou MACS |
| pré-enrichissement des cellules T EasySep Human CD4+CD127low | Stemcell Technologies | 19231 | Les alternatives sont le tri sur colonne FACS ou MACS EasySep |
| Human CD4+CD127lowCD25+ Kit d’isolement réglementaire des cellules T (alternative à l’article 12) | Stemcell Technologies | 18063 | Les alternatives sont le tri sur colonne FACS ou MACS |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-5442-03 | PBMC purification à partir du sang périphérique des produits de leucaphérèse ; gradient de densité moyen |
| Sérum AB humain (PHS-AB) | Valley Biomedical Inc | HP1022 | Composant de média |
| LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes bleues fixable, pour l’excitation UV | Thermo Fischer | L-34962 | Colorant |
| de viabilitéPhytohémagglutinine-L (PHA-L) | Stimulation par lymphocytes T | Millipore/Sigma | 11249738001 |
| IL-2 recombinante (par exemple, PROLEUKINâ ; )Stimulation | et maintenance des lymphocytes T | Prometheus | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Composant multimédia |
| Anticorps de coloration pour la cytométrie en flux (phénotypage Treg) | Voir « Commentaires" | Voir « Commentaires" | Les anticorps de coloration sont enrôlés dans : Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID : 30584695 ; PubMed Central PMCID : PMC6497402. En cas d’utilisation du kit de sélection positive CD25 humain EasySep, colorer avec un anticorps anti-CD25 2A3 ou BC96, par exemple : Brilliant Violet 421 anticorps CD25 humain (Biolegend ; 302629) |
| TCR V&beta ; Kit de répertoire ; IOTest Beta Mark | Beckman Coulter | PN IM3497 | Vérification des expansions pour la monoclonalité |
| Plaque de culture tissulaire, 96 puits, fond en U avec couvercle à faible évaporation | Corning | 353077 |
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Cet article a été publié
Vidéo bientôt disponible