Præsenteret her er en protokol til at opdage de overudtrykte driver gener opretholde de etablerede kræft stamceller-lignende celler stammer fra kolorektal HT29 celler. RNAseq med tilgængelig bioinformatik blev udført for at undersøge og screene genekspressionnetværk for at belyse en potentiel mekanisme, der er involveret i overlevelsen af målrettede tumorceller.
Kræft stamceller spiller en afgørende rolle mod kliniske behandlinger, bidrager til tumor tilbagefald. Der er mange onkogener involveret i tumorigenesis og indledningen af kræft stængelegenskaber. Da genekspression i dannelsen af kolorektal cancer-afledte tumorsfærer er uklart, det tager tid at opdage de mekanismer, der arbejder på et gen ad gangen. Denne undersøgelse viser en metode til hurtigt at opdage føreren gener involveret i overlevelsen af kolorektal cancer stamceller-lignende celler in vitro. Kolorektal HT29 kræftceller, der udtrykker LGR5 når dyrket som sfæroider og ledsage en stigning CD133 stængel markører blev udvalgt og brugt i denne undersøgelse. Den præsenterede protokol bruges til at udføre RNAseq med tilgængelige bioinformatik til hurtigt at afdække de overudtrykte driver gener i dannelsen af kolorektal HT29-afledte stængel-lignende tumorsfærer. Metoden kan hurtigt screene og opdage potentielle drivergener i andre sygdomsmodeller.
Kolorektal cancer (CRC) er en førende dødsårsag med høj prævalens og dødelighed påverdensplan 1,2. På grund af genmutationer og forstærkninger vokser kræftcellerne uden proliferativ kontrol, hvilket bidrager til celleoverlevelse3,anti-apoptose4og kræftstændthed5,,6,7. Inden for en tumor væv, tumor heterogenitet tillader tumorceller til at tilpasse sig og overleve under terapeutiske behandlinger8. Kræft stamceller (CSCs), med en højere grad af selvfornyelse og pluripotency end differentialkræft typer, er hovedansvarlige for tumor tilbagefald9,,10 og metastatisk CRC11. CsCs nuværende mere resistens12,,13,,14 og anti-apoptose egenskaber15,,16, dermed overlevende tumor kemoterapi.
Her, for at undersøge den potentielle mekanisme for stamtændighed i de udvalgte CRC stamceller, RNAseq blev udført for at screene differentieret udtrykte gener i tumor sfæroider. Kræftcellerne kan danne sfæroider (også kaldet tumorsfærer), når de dyrkes i lav overholdelse betingelser og stimuleres af vækstfaktorer føjet til dyrket medium, herunder EGF, bFGF, HGF, og IL6. Derfor valgte vi CRC HT29 tumorceller, der modstår kemoterapi med en stigning i fosforyleret STAT3, når de behandles med oxaliplatin og irinotecon17. Desuden udtrykte HT29 højere stængelmarkører, når de dyrkes under de beskrevne kulturforhold. Den HT29-afledte CSC-model udtrykte større mængder leucinrige gentagende G-protein-koblede receptor 5 (LGR5)18, en specifik markør for CRC-stamceller19,20. Desuden, CD133, betragtes som en generel biomarkør for kræft stamceller, er også meget udtrykt i HT29 cellelinje21. Denne protokol formål er at opdage grupper af driver gener i de etablerede kræft stilk-lignende tumorsfærer baseret på bioinformatik datasæt i modsætning til at undersøge individuelle onkogener22. Det undersøger potentielle molekylære mekanismer gennem RNAseq analyse efterfulgt af tilgængelige bioinformatik analyser.
Næste generation sekventering er en høj-throughput, let tilgængelige, og pålidelig DNA sekventering metode baseret på beregningsmæssige hjælp, der anvendes til omfattende skærm driver gener til at vejlede tumor behandlinger23. Teknologien bruges også til at detektere genekspression fra omvendt transskription af en isoleret RNA-prøve24. Men når screening med RNAseq, de vigtigste gener til at målrette med terapi kan ikke have den højeste udtryksforskel mellem eksperimentelle og kontrol prøver. Derfor er der udviklet bioinformatik til klassificering og identifikation af gener baseret på aktuelle datasæt som KEGG25,GO26,27eller PANTHER28, herunder Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 og NetworkAnalyst30. Denne protokol viser integrationen af RNAseq og NetworkAnalyst for hurtigt at opdage en gruppe af gener i de valgte HT29-afledte sfæroider sammenlignet med forældre HT29-celler. Anvendelse af denne metode til andre sygdomsmodeller er også foreslået for at opdage forskelle i vigtige gener.
Sammenlignet med undersøgelse af individuelle genekspression, en høj-throughput teknik giver fordele at finde potentielle driver gener nemt for tumor præcision medicin. Med nyttige datasæt som KEGG, GO eller PANTHER kan specifikke gener identificeres baseret på sygdomsmodeller, signalveje eller specifikke funktioner, og det giver mulighed for hurtigt at fokusere på specifikke, vigtige gener, hvilket sparer tid og forskningsomkostninger. En lignende ansøgning anvendes i tidligere undersøgelser14,18,31. Især, en tumor er mere kompliceret, fordi forskellige typer af tumorer udtrykke skelne gener og veje for overlevelse og spredning. Derfor kan denne protokol afhente gener, der adskiller forskellige tumortyper under forskellige omstændigheder. Der er potentiale til at finde effektive strategier mod kræft ved at forstå mekanismen for specifikke genekspression.
I denne undersøgelse, dyrket kræft stilk-lignende tumorsfærer blev brugt som en model i at analysere RNAseq data med tilgængelige bioinformatik. For en sygdom model, HT29-afledte tumorsfærer blev brugt. Fordi tumorsfærer har resistens over for tumorbehandlinger, den etablerede model kan bruges til at undersøge de detaljerede mekanismer for resistens ved at undersøge forskelle i genekspression. Desuden giver genomisk teknologi, der anvender RNAseq med tilgængelig bioinformatik, en hurtig forståelse af studiemode…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, for teknisk support. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Chang Gung Memorial hospital (CMRPD1J0321), Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06), og Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 og MMH-106-61). Finansieringsorganerne havde ingen indflydelse på udformningen af undersøgelsen og dataindsamlingen, analysen og fortolkningen af data eller skriftligt manuskriptet.
iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |