Opdagelsen af Driver Gener i Kolorektal HT29-afledt Cancer Stem-Lignende Tumorsfærer

Summary

Præsenteret her er en protokol til at opdage de overudtrykte driver gener opretholde de etablerede kræft stamceller-lignende celler stammer fra kolorektal HT29 celler. RNAseq med tilgængelig bioinformatik blev udført for at undersøge og screene genekspressionnetværk for at belyse en potentiel mekanisme, der er involveret i overlevelsen af målrettede tumorceller.

Abstract

Kræft stamceller spiller en afgørende rolle mod kliniske behandlinger, bidrager til tumor tilbagefald. Der er mange onkogener involveret i tumorigenesis og indledningen af kræft stængelegenskaber. Da genekspression i dannelsen af kolorektal cancer-afledte tumorsfærer er uklart, det tager tid at opdage de mekanismer, der arbejder på et gen ad gangen. Denne undersøgelse viser en metode til hurtigt at opdage føreren gener involveret i overlevelsen af kolorektal cancer stamceller-lignende celler in vitro. Kolorektal HT29 kræftceller, der udtrykker LGR5 når dyrket som sfæroider og ledsage en stigning CD133 stængel markører blev udvalgt og brugt i denne undersøgelse. Den præsenterede protokol bruges til at udføre RNAseq med tilgængelige bioinformatik til hurtigt at afdække de overudtrykte driver gener i dannelsen af kolorektal HT29-afledte stængel-lignende tumorsfærer. Metoden kan hurtigt screene og opdage potentielle drivergener i andre sygdomsmodeller.

Introduction

Kolorektal cancer (CRC) er en førende dødsårsag med høj prævalens og dødelighed på^{verdensplan 1,2}. På grund af genmutationer og forstærkninger vokser kræftcellerne uden proliferativ kontrol, hvilket bidrager til celleoverlevelse^3,anti-apoptose⁴og kræftstændthed^5,,6,7. Inden for en tumor væv, tumor heterogenitet tillader tumorceller til at tilpasse sig og overleve under terapeutiske behandlinger⁸. Kræft stamceller (CSCs), med en højere grad af selvfornyelse og pluripotency end differentialkræft typer, er hovedansvarlige for tumor tilbagefald^9,,10 og metastatisk CRC¹¹. CsCs nuværende mere resistens^12,,13,,14 og anti-apoptose egenskaber^15,,16, dermed overlevende tumor kemoterapi.

Her, for at undersøge den potentielle mekanisme for stamtændighed i de udvalgte CRC stamceller, RNAseq blev udført for at screene differentieret udtrykte gener i tumor sfæroider. Kræftcellerne kan danne sfæroider (også kaldet tumorsfærer), når de dyrkes i lav overholdelse betingelser og stimuleres af vækstfaktorer føjet til dyrket medium, herunder EGF, bFGF, HGF, og IL6. Derfor valgte vi CRC HT29 tumorceller, der modstår kemoterapi med en stigning i fosforyleret STAT3, når de behandles med oxaliplatin og irinotecon¹⁷. Desuden udtrykte HT29 højere stængelmarkører, når de dyrkes under de beskrevne kulturforhold. Den HT29-afledte CSC-model udtrykte større mængder leucinrige gentagende G-protein-koblede receptor 5 (LGR5)¹⁸, en specifik markør for CRC-stamceller^19,20. Desuden, CD133, betragtes som en generel biomarkør for kræft stamceller, er også meget udtrykt i HT29 cellelinje²¹. Denne protokol formål er at opdage grupper af driver gener i de etablerede kræft stilk-lignende tumorsfærer baseret på bioinformatik datasæt i modsætning til at undersøge individuelle onkogener²². Det undersøger potentielle molekylære mekanismer gennem RNAseq analyse efterfulgt af tilgængelige bioinformatik analyser.

Næste generation sekventering er en høj-throughput, let tilgængelige, og pålidelig DNA sekventering metode baseret på beregningsmæssige hjælp, der anvendes til omfattende skærm driver gener til at vejlede tumor behandlinger²³. Teknologien bruges også til at detektere genekspression fra omvendt transskription af en isoleret RNA-prøve²⁴. Men når screening med RNAseq, de vigtigste gener til at målrette med terapi kan ikke have den højeste udtryksforskel mellem eksperimentelle og kontrol prøver. Derfor er der udviklet bioinformatik til klassificering og identifikation af gener baseret på aktuelle datasæt som KEGG^25,GO^26,27eller PANTHER²⁸, herunder Ingenuity Pathway Analysis (IPA)²⁹ og NetworkAnalyst³⁰. Denne protokol viser integrationen af RNAseq og NetworkAnalyst for hurtigt at opdage en gruppe af gener i de valgte HT29-afledte sfæroider sammenlignet med forældre HT29-celler. Anvendelse af denne metode til andre sygdomsmodeller er også foreslået for at opdage forskelle i vigtige gener.

Sammenlignet med undersøgelse af individuelle genekspression, en høj-throughput teknik giver fordele at finde potentielle driver gener nemt for tumor præcision medicin. Med nyttige datasæt som KEGG, GO eller PANTHER kan specifikke gener identificeres baseret på sygdomsmodeller, signalveje eller specifikke funktioner, og det giver mulighed for hurtigt at fokusere på specifikke, vigtige gener, hvilket sparer tid og forskningsomkostninger. En lignende ansøgning anvendes i tidligere undersøgelser^14,18,31. Især, en tumor er mere kompliceret, fordi forskellige typer af tumorer udtrykke skelne gener og veje for overlevelse og spredning. Derfor kan denne protokol afhente gener, der adskiller forskellige tumortyper under forskellige omstændigheder. Der er potentiale til at finde effektive strategier mod kræft ved at forstå mekanismen for specifikke genekspression.

Protocol

1. Cellekultur og tumorsfæredannelse Kultur HT29 celler i en 10 cm skål, der indeholder Dulbecco’s modificerede ørn medium (DMEM) med 10% føtal kvæg serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin antibiotikum (P / S). Cellerne vokser i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2 og 95% luftfugtighed under aseptiske forhold, indtil de når 80% sammenflydende. Trypsinize HT29 celler med 1 ml af 0,25% trypsin i 5 min ved 37 °C og dermed neutralisere trypsin ved at tilføje 2 ml DMEM med 10% …

Representative Results

For at etablere modellen til undersøgelse af mekanismen i kræft stamceller, kolorektal HT29 celler blev brugt til at dyrke kræft stamceller in vitro i en lav-vedhæftede fil plade indeholdende B27, EGF, bFGF, HGF, og IL6. Tumorsfærerne >100 μm i diameter blev dannet i 7 dage (Figur 1A). Tumorsfærerne blev trypsiniseret til enkelte celler og analyseret ved hjælp af flowcytometri til at opdage LGR5 og CD133 udtryk. LGR5 steg i HT29-fordring tumorsfærer fra 1,1% til 11,4%, og cellerne b…

Discussion

I denne undersøgelse, dyrket kræft stilk-lignende tumorsfærer blev brugt som en model i at analysere RNAseq data med tilgængelige bioinformatik. For en sygdom model, HT29-afledte tumorsfærer blev brugt. Fordi tumorsfærer har resistens over for tumorbehandlinger, den etablerede model kan bruges til at undersøge de detaljerede mekanismer for resistens ved at undersøge forskelle i genekspression. Desuden giver genomisk teknologi, der anvender RNAseq med tilgængelig bioinformatik, en hurtig forståelse af studiemode…

Materials

iRiS Digital Cell Imaging System	Logos Biosystems, Inc	I10999	for observing the formation of tumorspheres
Flow cytometry	BD biosciences	FACSCalibur	for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres
anti-LGR5-PE	Biolegend	373803	LGR5 detection reagent
anti-CD133-PE	Biolegend	372803	CD133 detection reagent
EGF	GenScript	Z00333	for culture of tumorspheres
bFGF	GenScript	Z03116	for culture of tumorspheres
HGF	GenScript	Z03229	for culture of tumorspheres
IL6	GenScript	Z03034	for culture of tumorspheres
PureLink RNA extraction kit	Invitrogen	12183025	isolate total RNA for RNAseq analysis
RNAseq performance	Biotools, Taiwan		RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalyst	Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada		http://www.networkanalyst.ca/
Prism	GraphPad Software		a statistical analysis software