מדריך מקטעים, קורינג ועיבוד תמונה לרכש וניתוח מדגם עצם קליפת המוח בעל תפוקה גבוהה עבור מיקרו-CT של Synchrotron
Summary
השתמשנו בפרוטוקול דגימה גיאולוגי (coring) כדי להשיג דגימות עצם קליפת המוח בגודל אחיד לניסויי SRμCT מההיבט הקדמי של הפמורה האנושית. שיטה זו היא הרסנית מינימלית, יעילה, גורמת לדגימות גליליות הממזערות את ממצאי ההדמיה מצורות מדגם לא סדירות ומשפרות את ההדמיה והניתוח המיקרו-ארכי-ארכיאולוגיים.
Abstract
עצם היא רקמה דינמית ופעילה מכנית שמשתנה במבנה לאורך תוחלת החיים האנושית. המוצרים של תהליך שיפוץ העצם נחקרו באופן משמעותי באמצעות טכניקות דו מימדיות מסורתיות. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית הדמיית רנטגן באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו-שולחנית (μCT) וטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של קרינת סינכרוטרון (SRμCT) אפשרו רכישה של סריקות תלת מימדיות (3D) ברזולוציה גבוהה של שדה ראייה גדול יותר (FOV) מאשר טכניקות הדמיה תלת-ממדיות אחרות (למשל, SEM) המספקות תמונה מלאה יותר של מבנים מיקרוסקופיים בתוך עצם המוח האנושית. הדגימה צריכה להיות ממורכזת במדויק בתוך FOV, עם זאת, כדי להגביל את המראה של חפצי פס ידוע להשפיע על ניתוח נתונים. מחקרים קודמים דיווחו על רכש של בלוקי עצם מלבניים בצורה לא סדירה שתוצאתם היא ממצאי הדמיה עקב קצוות לא אחידים או חיתוך תמונה. יישמנו פרוטוקול דגימה גיאולוגי (coring) כדי להשיג דגימות ליבת עצם קליפת המוח בגודל עקבי עבור ניסויים SRμCT מההיבט הקדמי של femora האנושי. שיטת coring זו יעילה והרסנית מינימלית לרקמות. היא יוצרת דגימות גליליות אחידות המקטינות את ממצאי ההדמיה מטבעם של איזומטריות במהלך הסיבוב ומספקות אורך נתיב אחיד לקרני רנטגן לאורך הסריקה. עיבוד תמונה של נתונים טומוגרפיים רנטגן של דגימות cored בצורה לא סדירה מאשר את הפוטנציאל של הטכניקה כדי לשפר את ההדמיה וניתוח של מיקרוארכיטקטורה עצם קליפת המוח. מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה אמינה וחוזרת על עצמה להפקת ליבות עצם קליפת המוח הניתנת להתאמה לסוגים שונים של ניסויים בהדמיית עצם ברזולוציה גבוהה. מטרת העל של העבודה היא ליצור רכש עצם קליפת המוח סטנדרטי עבור SRμCT כי הוא סביר, עקבי, וישיר. הליך זה עשוי להיות מותאם עוד יותר על ידי חוקרים בתחומים קשורים אשר בדרך כלל להעריך חומרים מרוכבים קשים כגון אנתרופולוגיה ביולוגית, מדעי הרוח, או מדעי החומר.
Introduction
עם ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, כעת ניתן לרכוש נתוני הדמיית רנטגן ברזולוציה גבוהה מאוד. מערכות מיקרו-CT (μCT) שולחניות הן התקן הנוכחי להדמיה מבטלת עצם בשל אופין הבלתי הרסני1. עם זאת, בעת הדמיה של תכונות מיקרו-מבניות של עצם קליפת המוח, השימוש במיקרו-טקט היה מוגבל יותר. בשל אילוצי רזולוציה, מערכות שולחן עבודה אינן יכולות להשיג את הרזולוציה הנדרשת כדי לצלם תכונות מיקרו-מבניות קטנות יותר מנקבוביות קליפת המוח, כגון לקונה אוסטאוציט. עבור יישום זה, SRμCT הוא אידיאלי בשל הרזולוציה הגדולה יותר של מערכות אלה1. לדוגמה, ניסויים במקור האור הקנדי (CLS) על קווי ההדמיה והטיפול הביו-רפואי (BMIT)2 יצרו תמונות עם voxels קטן כמו 0.9 מיקרומטר. מחקריםקודמים 1,3,4,5 השתמשו ברזולוציה זו כדי להשיג תחזיות ולאחר מכן תלת מימדי (3D) עיבודים מדגימות עצם קליפת המוח מעצמות אדם ארוכות ( איור1) כדי לכמת צפיפות lacunar osteocyte4,6,7,8,9 וריאציה בצורת לקונה וגודל3 על פני תוחלת החיים האנושית ובין המינים. מחקרים נוספים הראו את נוכחותם של רצועות אוסטאון בבני אדם10, תופעה שהוכרה בעבר כמזוהה רק עם יונקים לא אנושיים בספרות האנתרופולוגית המשפטית.
על מנת להשיג רזולוציה יוצאת דופן, קרן הרנטגן חייבת להיות ממוקדת דק בתוך שדה הראייה (FOV), אשר לעתים קרובות מגביל את גודל הדגימה המרבי לכמה מילימטרים בקוטר. נכון לעכשיו, לא היו נהלים מקיפים ומתוקננים המתוארים בספרות המתארים רכש מדגם עצם העומדים במגבלות אלה. מרכוז דגימות בתוך FOV הוא קריטי כדי להבטיח כי 1) המדגם נשאר ממורכז כפי שהוא מסתובב 180 ° במהלך ההדמיה, ו 2) ממצאי סריקה מוגבלים מאז אין חיתוך תמונה. במילים אחרות, אין חלקים של המדגם מחוץ FOV להפריע הקרן הזנת המוקד שלה בתוך FOV. במקרה כזה, אלגוריתם השחזור נשלל מחלק מנתוני ההפחתה הדרושים לשחזור נכון לחלוטין. ראוי עוד לציין כי 360 ° (סיבוב מלא) סריקות למזער את ההשפעות של התקשות קרן אבל להגדיל חפצים שנגרמו על ידי אי התאמות ותנועה מדגם במהלך ההדמיה. לכן, בעוד שסריקה של 360° בדרך כלל תיצור נתונים נקיים יותר, זמן ההדמיה יוכפל ולכן יש לטפל בפשרה בין עלות הניסוי לאיכות הנתונים.
היבט חשוב ולעתים קרובות מתעלמים מניסויי הדמיית עצם הוא טכניקת הכנת הדגימה המדויקת והמשכפלת המבוצעת לפני הסריקה. מחקרים המשלבים שיטות SRμCT בניסויים שלהם מזכירים בקצרה את פרוטוקול הדגימה שלהם, אך המחברים מספקים מעט מאוד פרטים לגבי המתודולוגיה המסוימת המשמשת לאיסוף הדגימות שלהם. מחקרים רבים כאלה מזכירים חיתוך קוביות עצם מלבניות של ממדים שרירותיים, אך בדרך כלל אינם מספקים מידע נוסף על הכלים או חומרי ההטבעה המשמשים3,4,10,11,12,13,14. חוקרים מסוימים משתמשים בדרך כלל בכלים סיבוביים כף יד (למשל, דרמל) כדי להסיר בלוקים מליניאריים של עצם מאזור עניין (ROI)3,4,10,11,12,13,14. שיטה זו גורמת לדגימות בגודל לא אחיד שעשויות להיות גדולות יותר מה- FOV, מה שמגדיל את הסבירות של ממצאי סריקה וחיתוך תמונה. דגימות כאלה דורשות לעתים קרובות זיקוק נוסף באמצעות מסור מדויק של וופל יהלומים (למשל, Buehler Isomet). השגת דגימות עם ממדים עקביים (עד מאתיים/מ”מ) היא קריטית כדי להבטיח שערכות הנתונים הנרכשות הן באיכות הגבוהה ביותר והתוצאות הבאות ניתנות לשכפול.
הדיווח המוגבל על מתודולוגיית הרכש לדוגמה מוסיף שכבה נוספת של קושי בעת ניסיון להפעיל ו/או לאמת שיטות שבוצעו במחקר קודם. נכון לעכשיו, החוקרים חייבים ליצור קשר עם המחברים ישירות לקבלת פרטים נוספים על הליכי הדגימה שלהם. הפרוטוקול המפורט כאן מספק לחוקרים ביו-רפואיים טכניקת דגימה מתועדת ביסודיות, שכפול וחסכונית. המטרה העיקרית של מאמר זה היא לספק הדרכה מקיפה לגבי איך להשיג דגימות ליבת עצם קליפת המוח בגודל עקבי באמצעות מכבש טחנה קידוח קצת coring יהלום עבור הדמיה מדויקת והפקת נתונים מיקרו ארכיאולוגיים. שיטה זו משתנה מהליכים המשמשים לאיסוף צילינדרים אחידים בקוטר קטן (1-5 מ”מ) מבלוקים של חומרים קשים במכניקת סלע בלחץ גבוה15,16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
לא היה פרוטוקול מקיף ומתוקנן לרכש דגימות ליבת עצם קליפת המוח האחידת והגלינדרית להדמיית SRμCT ברזולוציה גבוהה עם הגדרות FOV מוגבלות. הפרוטוקול המפורט כאן ממלא את החלל הזה על ידי מתן הדרכה מקיפה לגבי איך להשיג דגימות ליבת עצם קליפת המוח בגודל עקבי עבור הדמיית SRμCT ואת ההדמיה המדויקת הבאים והפקת…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר המתואר במאמר זה בוצע במתקן BMIT במקור האור הקנדי, הנתמך על ידי קרן קנדה לחדשנות, מדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסי של קנדה, אוניברסיטת ססקצ’ואן, ממשלת ססקצ’ואן, גיוון כלכלי מערבי קנדה, מועצת המחקר הלאומית קנדה והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות. המחברים רוצים להודות למדעני הקורה במקור האור הקנדי, ובמיוחד לאדם ווב, דניס מילר, סרגיי גאסילוב ונינג זו על הסיוע בהקמה ופתרון בעיות של מערכות המיקרוסקופ SkyScan SRμCT וקרן לבנה. ברצוננו גם להודות לבית דלזל מאוניברסיטת טולדו קולג’ לרפואה ומדעי החיים ולד”ר ג’פרי וונסטופ מהאוניברסיטה הרפואית של צפון מזרח אוהיו על הגישה לדגימות קעורות למחקר זה. JM Andronowski נתמך באמצעות קרנות מחקר סטארט-אפ המסופקות על ידי אוניברסיטת אקרון ומכון לאומי למחקר ופיתוח צדק במדעי הזיהוי הפלילי למטרות צדק פלילי (2018-DU-BX-0188). RA דייוויס נתמך על ידי עוזר בוגר המסופק על ידי אוניברסיטת אקרון. ציוד ואספקה המשמשים coring ו ניסור נרכשו על ידי קרנות סטארט-אפ שסופקו על ידי אוניברסיטת אקרון ו NSF להעניק EAR-1624242 ל CW Holyoke.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source – part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
- Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
- . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
