قسم، Coring، ودليل معالجة الصور لارتفاع الإنتاجية اختبار العظام كورتيكية الشراء وتحليل لSynchrotron الدقيقة CT
Summary
استخدمنا بروتوكول أخذ العينات الجيولوجي (coring) لشراء عينات العظام القشرية من حجم موحد لتجارب SRμCT من الجانب الأمامي من femora الإنسان. هذه الطريقة هي الحد الأدنى من التدمير، والكفاءة، والنتائج في العينات أسطواني التي تقلل القطع الأثرية التصوير من الأشكال عينة غير منتظمة ويحسن التصور والتحليل microarchitectural.
Abstract
العظام هي الأنسجة الديناميكية والميكانيكية النشطة التي تتغير في هيكل على مدى عمر الإنسان. وقد درست منتجات عملية إعادة عرض العظام بشكل كبير باستخدام التقنيات التقليدية ثنائية الأبعاد. وقد سمحت التطورات الأخيرة في تكنولوجيا التصوير بالأشعة السينية عن طريق التصوير المقطعي المحوسب المكتبي (μCT) والتصوير المقطعي المحوسب بالإشعاع السنكروترون (SRμCT) بالحصول على فحوصات ثلاثية الأبعاد عالية الدقة (3D) لمجال رؤية أكبر (FOV) من تقنيات التصوير ثلاثية الأبعاد الأخرى (مثل SEM) التي توفر صورة أكثر اكتمالًا للهياكل المجهرية داخل العظام القشرية البشرية. وينبغي أن تركز العينة بدقة داخل FOV، ومع ذلك، للحد من مظهر القطع الأثرية المتتالية المعروفة لتأثير تحليل البيانات. وقد أفادت الدراسات السابقة شراء كتل العظام المستقيمة على شكل غير منتظم التي تؤدي إلى تصوير القطع الأثرية بسبب حواف متفاوتة أو اقتطاع الصورة. لقد طبقنا بروتوكول أخذ العينات الجيولوجية (coring) لشراء عينات من العظم القشري بالحجم باستمرار لتجارب SRμCT من الجانب الأمامي من femora الإنسان. هذا الأسلوب coring هو كفاءة والحد الأدنى من التدمير لالأنسجة. فهو يخلق عينات أسطوانية موحدة تقلل من القطع الأثرية التصويرية بطبيعتها من كونها متساوي القياس أثناء الدوران وتوفر طول مسارًا موحدًا لشعاع الأشعة السينية طوال المسح الضوئي. إن معالجة الصور لبيانات التصوير الشعاعية السينية للعينات ذات الشكل الوصويف والمجسّد بشكل غير منتظم تؤكد إمكانية هذه التقنية لتحسين التصور والتحليل للرقم المجهري للعظام القشرية. هدف هذا البروتوكول هو تقديم طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لاستخراج نوى العظام القشرية التي يمكن تكييفها لأنواع مختلفة من تجارب التصوير العظام عالية الدقة. الهدف الشامل للعمل هو إنشاء شراء عظام كورتيكال موحدة لـ SRμCT بأسعار معقولة ومتسقة ومباشرة. ويمكن أيضاً تكييف هذا الإجراء من قبل الباحثين في المجالات ذات الصلة الذين يقومون عادة بتقييم المواد المركبة الصلبة مثل الأنثروبولوجيا البيولوجية أو العلوم الجيولوجية أو علوم المواد.
Introduction
مع التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير، أصبح من الممكن الآن الحصول على بيانات التصوير بالأشعة السينية بدقة عالية جداً. أجهزة التصوير المقطعي الصغرى لسطح المكتب (μCT) هي المعيار الحالي لتصوير العظام الملغاة بسبب طبيعتها غير المدمرة1. عند تصوير السمات المجهرية للعظم القشري، ومع ذلك، كان استخدام μCT أكثر محدودية. بسبب قيود الدقة، لا يمكن أن تصل أنظمة سطح المكتب إلى الدقة المطلوبة لصورة ميزات microstructural أصغر من المسام القشرية، مثل الثغرات في الجهاز العظمي. لهذا التطبيق، SRμCT مثالية نظراً لقرار أكبر من هذه الأنظمة1. على سبيل المثال، أنتجت التجارب في “مصدر الضوء الكندي” (CLS) على خطوط الشعاع البيولوجية الطبية للتصوير والعلاج (BMIT)2 صورًا ذات voxels صغيرة مثل 0.9 ميكرومتر. الدراسات السابقة1,3,4,5 استخدمت هذا القرار للحصول على الإسقاطات ولاحقة ثلاثية الأبعاد (3D) يجعل من عينات العظام القشرية من العظام الطويلة البشرية ( الشكل1) لتحديد كثافة الثغرات في العظام4,6,7,8,9 والاختلاف في شكل الثغرات والحجم3 عبر عمر الإنسان وبين الجنسين. وقد أظهرت دراسات أخرى وجود عصابة أوستيون في البشر10، وهي ظاهرة معترف بها سابقا أن تكون مرتبطة فقط مع الثدييات غير البشرية في الأدب الأنثروبولوجيا الطب الشرعي.
من أجل تحقيق قرار استثنائي، يجب أن تكون تركيز شعاع الأشعة السينية بدقة داخل مجال الرؤية (FOV)، والذي غالبا ما يحد من حجم العينة القصوى إلى بضعة ملليمترات في القطر. في الوقت الحالي، لا توجد إجراءات شاملة وموحدة موصوفة في المؤلفات التي تحدد شراء عينات العظام التي تفي بهذه القيود. تمركز العينات داخل FOV أمر بالغ الأهمية لضمان أن 1) العينة لا تزال مركزة لأنها تدور 180 درجة أثناء التصوير، و 2) القطع الأثرية المسح محدودة لأنه لا يوجد اقتطاع صورة. وبعبارة أخرى، لا تتداخل أي أجزاء من العينة خارج FOV مع الشعاع الذي يدخل نقطة الاتصال داخل FOV. إذا حدث ذلك، يتم حرمان خوارزمية إعادة البناء من بعض بيانات التوهين اللازمة لإعادة بناء صحيحة تماماً. ومن الجدير بالذكر كذلك أن 360 درجة (دوران كامل) بمسح يقلل من آثار تصلب شعاع ولكن زيادة القطع الأثرية الناجمة عن سوء المحاذاة وحركة العينة أثناء التصوير. وهكذا، في حين أن المسح الضوئي 360 درجة عادة ما تولد بيانات أنظف، يتم مضاعفة وقت التصوير، وبالتالي يجب معالجة حل وسط بين التكلفة التجريبية وجودة البيانات.
جانب مهم وغالبا ما يغفل من تجارب تصوير العظام هو دقيقة وقابلة للتكرار تقنية إعداد العينة التي أجريت قبل المسح الضوئي. تشير الدراسات التي تدمج أساليب SRμCT في تجاربها بإيجاز إلى بروتوكول أخذ العينات، ولكن المؤلفين يقدمون القليل من التفاصيل أو لا يقدموا أي تفاصيل حول المنهجية المعينة المستخدمة لجمع عيناتهم. العديد من هذه الدراسات تذكر قطع كتل العظام المستقيمة من أبعاد التعسفي، ولكن عموما لا تقدم المزيد من المعلومات حول الأدوات أو تضمين المواد المستخدمة3،4،10،11،12،13،14. يستخدم بعض الباحثين عادة أدوات دوارة محمولة (على سبيل المثال ، Dremel) لإزالة كتل العظم المستقيم من منطقة ذات أهمية (ROI)3،4،10،11،12،13،14. ينتج هذا الأسلوب في نماذج غير ذات حجم غير مُتّمَسَر قد تكون أكبر من FOV، مما يزيد احتمالية مسح artifacts و اقتطاع الصورة. وكثيراً ما تتطلب هذه العينات المزيد من التكرير باستخدام منشار دقيق منشار الماس ويفر (مثل بوهلر إيسميت). 10 – إن شراء عينات ذات أبعاد متسقة (إلى مئتين/مم) أمر بالغ الأهمية لضمان أن تكون مجموعات البيانات المكتسبة على أعلى مستوى من الجودة وأن تكون النتائج اللاحقة قابلة للتكرار.
ويضيف الإبلاغ المحدود عن منهجية الشراء العينية طبقة إضافية من الصعوبة عند محاولة استخدام و/أو التحقق من الأساليب التي تم تنفيذها في دراسة سابقة. وفي الوقت الحالي، يجب على الباحثين الاتصال بواكّبهم مباشرة للحصول على مزيد من التفاصيل حول إجراءات أخذ العينات الخاصة بهم. البروتوكول المفصل هنا يوفر للباحثين في الطب الحيوي تقنية أخذ العينات الموثقة تمامًا وقابلة للتكرار وفعالة من حيث التكلفة. الهدف الأساسي من هذه المقالة هو توفير برنامج تعليمي شامل حول كيفية شراء عينات جوهر العظام القشرية ذات الحجم الثابت باستخدام ضغط مطحنة الحفر والماس coring بت للتصور الدقيق واستخراج البيانات microarchitectural. يتم تعديل هذه الطريقة من الإجراءات المستخدمة لجمع بشكل روتيني موحد، صغيرة القطر (1-5 ملم) اسطوانات من كتل من المواد الصلبة في الميكانيكا الصخور عالية الضغط15،16،17،18،19.
Protocol
Representative Results
Discussion
لم يكن هناك بروتوكول شامل وموحد لشراء عينات من اللبات العظمية القشرية الموحدة والاسطوية للتصوير SRμCT عالي الدقة مع أجهزة FOV محدودة. البروتوكول مفصلة هنا يملأ هذا الفراغ من خلال توفير البرنامج التعليمي الشامل بشأن كيفية شراء باستمرار الحجم عينات العظام الأساسية القشرية للتصوير SRμCT والتصو?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أجريت البحوث الموصوفة في هذه الورقة في مرفق BMIT في المصدر الضوئي الكندي، الذي تدعمه المؤسسة الكندية للابتكار والعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا، وجامعة ساسكاتشوان، وحكومة ساسكاتشوان، وغرب كندا لتنويع الاقتصاد، والمجلس الوطني للبحوث الكندية، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية. الكتاب يود أن يشكر العلماء في شعاع مصدر الضوء الكندي ، ولا سيما آدم ويب ، دينيس ميلر ، سيرجي Gasilov ، ونينغ زو للمساعدة في إعداد واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من أنظمة SRμCT وSRμCT شعاع أبيض. كما نود أن نشكر بيث دالزيل من كلية الطب وعلوم الحياة في جامعة توليدو والدكتور جيفري وينستروب من جامعة أوهايو الطبية الشمالية الشرقية على الحصول على عينات كادفيكريك لهذه الدراسة. يتم دعم JM Andronowski من خلال صناديق الأبحاث الناشئة التي تقدمها جامعة أكرون والمعهد الوطني لبحوث العدالة والتنمية في مجال علوم الطب الشرعي لأغراض العدالة الجنائية منحة (2018-DU-BX-0188). يتم دعم RA ديفيس من قبل مساعد الدراسات العليا التي تقدمها جامعة أكرون. تم شراء المعدات واللوازم المستخدمة في التعبئة و الانتشار من خلال أموال بدء التشغيل المقدمة من جامعة أكرون و NSF منحة EAR-1624242 إلى CW Holyoke.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source – part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
- Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
- . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
