Een sectie-, coring- en beeldverwerkingshandleiding voor aanschaf en analyse van corticale botmonsters met hoge doorvoer voor Synchrotron Micro-CT
Summary
We gebruikten een geologisch (coring) bemonsteringsprotocol om corticale botmonsters van uniforme grootte aan te schaffen voor SRμCT-experimenten vanuit het voorste aspect van menselijke femora. Deze methode is minimaal destructief, efficiënt, resulteert in cilindrische specimens die beeldvormingsartefacten uit onregelmatige monstervormen minimaliseren en microarchitecturale visualisatie en analyse verbeteren.
Abstract
Bot is een dynamisch en mechanisch actief weefsel dat in structuur verandert gedurende de menselijke levensduur. De producten van het botremodelleringsproces zijn aanzienlijk bestudeerd met behulp van traditionele tweedimensionale technieken. Recente vooruitgang in röntgenbeeldvormingstechnologie via desktop micro-computed tomografie (μCT) en synchrotronstraling micro-computertomografie (SRμCT) hebben de aanschaf mogelijk gemaakt van driedimensionale (3D) scans met hoge resolutie van een groter gezichtsveld (FOV) dan andere 3D-beeldvormingstechnieken (bijv. SEM) die een vollediger beeld geven van microscopische structuren in menselijk corticale bot. Het monster moet echter nauwkeurig worden gecentreerd binnen de FOV om het uiterlijk te beperken van streepartefacten waarvan bekend is dat ze van invloed zijn op gegevensanalyse. Eerdere studies hebben gemeld inkoop van onregelmatig gevormde rechtlijnige botblokken die resulteren in beeldvorming artefacten als gevolg van ongelijke randen of beeldverloop. We hebben een geologisch bemonsteringsprotocol (coring) toegepast om corticale botkernmonsters van consistente grootte aan te schaffen voor SRμCT-experimenten vanuit het voorste aspect van menselijke femora. Deze coring methode is efficiënt en minimaal destructief voor weefsel. Het creëert uniforme cilindrische monsters die beeldvormingsartefacten verminderen door isometrisch te zijn tijdens rotatie en een uniforme padlengte bieden voor röntgenstralen tijdens het scannen. Beeldverwerking van röntgentomografische gegevens van cored en onregelmatig gevormde monsters bevestigt het potentieel van de techniek om visualisatie en analyse van corticale botmicroarchitectuur te verbeteren. Een doel van dit protocol is om een betrouwbare en herhaalbare methode te leveren voor de extractie van corticale botkernen die kan worden aangepast voor verschillende soorten botbeeldvormingsexperimenten met hoge resolutie. Een overkoepelend doel van het werk is om een gestandaardiseerde corticale botaankoop voor SRμCT te creëren die betaalbaar, consistent en eenvoudig is. Deze procedure kan verder worden aangepast door onderzoekers op verwante gebieden die vaak harde composietmaterialen evalueren, zoals in de biologische antropologie, geowetenschappen of materiaalwetenschappen.
Introduction
Met recente vooruitgang in beeldvormingstechnologie is het nu haalbaar om röntgenbeeldgegevens met een zeer hoge resolutie te verkrijgen. Desktop micro-CT (μCT) systemen zijn de huidige standaard voor imaging cancellous bot vanwege hun niet-destructieve aard1. Bij het in beeld brengen van microstructurele kenmerken van corticale bot is het gebruik van μCT echter beperkter geweest. Vanwege resolutiebeperkingen kunnen desktopsystemen niet de resolutie bereiken die nodig is om microstructurele functies kleiner te maken dan corticale poriën, zoals osteocytenlacunee. Voor deze toepassing is SRμCT ideaal vanwege de grotere resolutie van deze systemen1. Experimenten bij de Canadian Light Source (CLS) op de BioMedical Imaging and Therapy (BMIT) beamlines2 hebben bijvoorbeeld beelden opgeleverd met braaksel tot 0,9 μm. Eerdere studies1,3,4,5 hebben deze resolutie gebruikt om projecties en daaropvolgende driedimensionale (3D) renders van corticale botmonsters uit menselijke lange botten te verkrijgen ( figuur1) om de osteocyten lacunairedichtheid 4,6,7, 8,9 en variatie in de lacunaire vorm en grootte3 over de menselijke levensduur en tussen de geslachten te kwantificeren. Verdere studies hebben de aanwezigheid van osteon banding bij mensenaangetoond 10, een fenomeen dat eerder werd erkend als geassocieerd met alleen niet-menselijke zoogdieren in de forensische antropologische literatuur.
Om een uitzonderlijke resolutie te bereiken, moet de röntgenstraal fijn worden scherpgesteld binnen het gezichtsveld (FOV), waardoor de maximale monstergrootte vaak beperkt blijft tot een paar millimeter in diameter. Momenteel zijn er geen uitgebreide, gestandaardiseerde procedures beschreven in de literatuur waarin botmonsteraankopen worden beschreven die aan deze beperkingen voldoen. Het centreren van specimens binnen de FOV is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat 1) het monster gecentreerd blijft terwijl het 180° draait tijdens de beeldvorming, en 2) scanartefacten zijn beperkt omdat er geen beeldverloop is. Met andere woorden, geen delen van het monster buiten de FOV interfereren met de straal die zijn brandpunt in de FOV binnendringt. Als dit gebeurt, wordt het reconstructiealgoritme beroofd van enkele van de dempingsgegevens die nodig zijn voor een volledig correcte reconstructie. Het is verder vermeldenswaardig dat 360° (volledige rotatie) scans de effecten van straalverharding minimaliseren, maar artefacten verhogen die worden veroorzaakt door verkeerde uitlijning en monsterbeweging tijdens beeldvorming. Hoewel een 360°-scan doorgaans schonere gegevens genereert, wordt de beeldtijd verdubbeld en moet dus een compromis tussen experimentele kosten en gegevenskwaliteit worden aangepakt.
Een belangrijk en vaak over het hoofd gezien aspect van botbeeldvormingsexperimenten is de nauwkeurige en reproduceerbare specimenvoorbereidingstechniek die voorafgaand aan het scannen wordt uitgevoerd. Studies die SRμCT-methoden in hun experimenten opnemen, vermelden kort hun bemonsteringsprotocol, maar de auteurs geven weinig tot geen details over de specifieke methodologie die wordt gebruikt om hun specimens te verzamelen. Veel van dergelijke studies vermelden het snijden van rechtlijnige botblokken van willekeurige afmetingen, maar geven over het algemeen geen verdere informatie over de gebruikte gereedschappen of inbeddingsmaterialen3,4,10,11,12,13,14. Sommige onderzoekers gebruiken vaak handheld roterende gereedschappen (bijv. Dremel) om rechtlijnige botblokken uit een interessegebied te verwijderen (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Deze methode resulteert in niet-uniforme monsters die groter kunnen zijn dan de FOV, waardoor de kans op scanartefacten en beeldverloop toeneemt. Dergelijke exemplaren vereisen vaak verdere raffinage met behulp van een precisie diamantwafelzaag (bijv. Buehler Isomet). Het verkrijgen van monsters met consistente afmetingen (tot de twee honderdsten/mm) is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de verworven gegevenssets van de hoogste kwaliteit zijn en de daaropvolgende resultaten reproduceerbaar zijn.
De beperkte rapportage van de steekproefaankoopmethodologie voegt een extra moeilijkheidslaag toe bij het gebruik en/of valideren van methoden die in een eerdere studie zijn uitgevoerd. Momenteel moeten onderzoekers rechtstreeks contact opnemen met auteurs voor meer informatie over hun bemonsteringsprocedures. Het protocol dat hier wordt beschreven, biedt biomedische onderzoekers een grondig gedocumenteerde, reproduceerbare en kostenefficiënte bemonsteringstechniek. Het primaire doel van dit artikel is om een uitgebreide tutorial te geven over het verkrijgen van consistent formaat corticale botkernmonsters met behulp van een freespers en diamantkorf voor de nauwkeurige visualisatie en extractie van microarchitectuurgegevens. Deze methode wordt gewijzigd van procedures die worden gebruikt om routinematig uniforme cilinders met een kleine diameter (1-5 mm) te verzamelen uit blokken harde materialen in hogedrukgesteentemechanica15,16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er is geen uitgebreid, gestandaardiseerd protocol voor de aanschaf van uniforme en cilindrische corticale botkernmonsters voor SRμCT-beeldvorming met hoge resolutie met beperkte FOV-opstellingen. Het protocol dat hier wordt beschreven, vult die leegte op door een uitgebreide zelfstudie te geven over het verkrijgen van consistent formaat corticale botkernmonsters voor SRμCT-beeldvorming en de daaropvolgende nauwkeurige visualisatie en extractie van microarchitectuurgegevens. We hebben aangetoond dat ons protocol een mee…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het in dit artikel beschreven onderzoek werd uitgevoerd in de BMIT-faciliteit van de Canadian Light Source, die wordt ondersteund door de Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, de University of Saskatchewan, de regering van Saskatchewan, Western Economic Diversification Canada, de National Research Council Canada en de Canadian Institutes of Health Research. De auteurs willen de beamline-wetenschappers van de Canadese lichtbron, met name Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov en Ning Zu, bedanken voor de hulp bij het opzetten en oplossen van problemen met de SkyScan SRμCT- en witstraalmicroscoopsystemen. We willen ook Beth Dalzell van het University of Toledo College of Medicine and Life Sciences en Dr. Jeffrey Wenstrup van de Northeast Ohio Medical University bedanken voor de toegang tot kadavermonsters voor deze studie. JM Andronowski wordt ondersteund door start-up onderzoeksfondsen van de Universiteit van Akron en een National Institute of Justice Research and Development in Forensic Science for Criminal Justice Purposes grant (2018-DU-BX-0188). RA Davis wordt ondersteund door een graduate assistantship van de Universiteit van Akron. Apparatuur en benodigdheden die worden gebruikt voor het zagen en zagen werden gekocht door startfondsen van de Universiteit van Akron en NSF-subsidie EAR-1624242 aan CW Holyoke.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source – part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
- Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
- . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
